Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Вопросы регуляции экспрессии генов rm в первую очередь рассматриваются через призму того, каким образом обеспечивается скоординированный синтез рестриктазы и метилазы* исключающий возможность недометилирования ДНК. Опасность для выживания клетки могла бы возникнуть в случае отсутствия метилазной активности. Учитывая такие факты, как:
1) общепринятое мнение, что гены rm экспрессируются конститутивно;
2) для защиты ДНК от действия рестриктазы достаточно наличия модифицированного основания только в одной из цепей последовательности нуклеотидов узнаваемой рестриктазой (обычная ситуация наблюдаемая после репликации ДНК);
3) в клетках присутствуют системы, обеспечивающие-репарацию двухнитевых и однонитевых разрывов, маловероятно возникновение случаев самоубийства клетки собствен-
ной рестриктазой (за исключением случаев инактивации гена метилазы вследствии мутации). Совершенно другая ситуация имеется в случае клонирования генов гш или их установления в новом штамме в природных условиях. Предполагается, что опережающая экспрессия гена метилазы является необходимым условием для успешного одновременного клонирования гена сопряженной рестриктазы. Относительно большое число примеров клонирования генов rm в Е. coli служит указанием на то, что каким то образом это условие выполняется. Это тем более удивительно, так как большинство перенесенных в' кишечную палочку генов rm являются чужеродными (гетерологичными) по таксономическому происхождению реципиентному штамму. Вопрос о том, отражает ли это эволюционно закрепленную специфику генов rm или определяется случайными причинами, пока остается открытым. Мало что для обсуждения дают сведения о многочисленных примерах другого характера — неудачных опытах по клонированию генов rm, так как в этих случаях отрицательный результат может быть обусловлен многими причинами не связанными со скоординированным синтезом метилазы и рестриктазы.
Общепринято, что для успешного клонирования генов rm необходимо, чтобы они экспрессировались и экспрессировались скоординированно в том смысле, как этот вопрос обсуждается в контексте настоящего обзора. Рассмотрим данные служащие основой для рассуждений о том каким образом выполняются эти требования.
9.2.1. Структура регуляторных областей генов rm
Среди факторов способных влиять на уровень экспрессии генов rm рассматриваются — способ транскрипции (оперонный или для каждого из генов раздельный) структура последовательностей ДНК в 5’ и 3’ областях, окружающих структурные гены; GC состав структурных генов; частота использования кодонов, пространственная структура иРНК; наличие посттран-сляционного процессинга.
Особенности промоторной области, прилегающей с 5’ конца к структурным генам влияют на уровень экспрессии (транскрипции). У прокариотических микроорганизмов это так называемые —10 (Прибнов бокс) и —35 последовательности, определяющие силу взаимодействия с РНК полимеразой [324,3481. На уровень трансляции влияет последовательность SD (Шайн-Делгарно) [345], транскрипт которой составляет часть иРНК и определяет ее взаимодействие с 3’ концом 16S РНК в рибосомах. В табл. 21 представлены данные о наличии и структуре этих, последовательностей в промоторных областях клонированных генов rm. Как видно наличие таких последовательностей в той или иной мере приближенных по структуре к
каноническим для Е. coli в ряде случаев наблюдается. Поэтому в этих случаях не возникает вопроса о механизмах экспрессии, которые могут быть реализованы соответствующими компонентами транскрипционного аппарата Е. coli. В остальных случаях перед структурными генами обсуждаемые последовательности частично или вообще не представлены (см. табл. 21), но это не препятствует их экспрессии. Это говорит об участии в регуляции транскрипции и (или) трансляции, либо последовательностей других, чем обсуждаемые, структур, либо транскрипции генов с промоторов расположенных в векторных
Таблица 21
Структура регуляторных областей генов rm
Ген Область---35 Рас Область---Ю SD последова
стоя тельность
ние в
парах
нук
леоти
дов
Е. coli* TTGACA 16-19 ТАТААТ TAAGGAGGTG
MPst I TTATTA 16 gATAcT
RPst I TTAAtA 23 TAgAgT
МНра II GAGG
RHha II GGAG
MEcoR I TTGAac 17 TATttT TAAGG
REcoR I GGANsGGA
MPaeR7 TTGcCg 13 TgTcATG
RPaeR7 GGAG
MTaq I
