Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
RTaq I TAAGGAGG
MDde I GGAG
RDde I TTGAct 15 ТАТААТ GGGG
MBsuR I TAagAT AGGAGG
RBsuR I TActAT GAGG
MecoR V TTGAgA 17 TATttT GGT
RecoR V TTGcaA 19 TAcAcT GOA
RMDpn 11
<M)dpnM TTGAtA 17 TAaAAT AATTTCTN
TATA
(M)dpnA AATTTCTNs-
(R)dpnB TATA
GGAGG
RDpn I
(R)dpnC TTGoC 20 TtaAAT GGTG
(?)dpnD AGGAN4ATC
MEcoR II TTcAat 17 TAcAgT GGAGG
MBspR I TTGtCA 17 TAaAcT AAGG
RSin I TTGACt 22 TATAcT GGAGGT
MSin I TTGACt 17 cATAAT GGA
Расстояние до АТОв парах нуклеотидов
Литера-
тура
3-11
13
9
9
3
4 9
5 10
9
7
8
9
10
11
7
4
9
4
14
[348, 324 345]
[385] [347 [347 [148, 277{ [148, 277Г [370 [370 [350 [350 [365 [365 [206 [206 [88] [88]
[119, 221]
[119]
[•119, 221]
[221]
[221]
[356]
[298]
Ц99]
[199]
а —канонические структуры —35 и —10 областей, характерные для генов Е. coli приводится по [324, 348], a SD последовательности по [345].
молекулах. Последнее было подтверждено в случае генов RMHha II, MTaq I и MBsp I [217, 347, 350], поэтому остается правомочным первое предположение.
Резюмируя рассмотренные данные напрашивается вывод о том, что уровень приближенности структуры промоторных областей генов rm к канонической для Е. coli не является единственным фактором, однозначно определяющим возможность экспрессии (как скоординированной, так и по принципу «да» или «нет») гетерологичных по происхождению генов (и тем самым успех клонирования генов гш). Конечно, не исключены случаи, когда этот фактор может явиться решающим.
9.2.2. Возможные механизмы скоординированной экспрессии генов гт
Отсутствие молекулярно-генетических препятствий для экспрессии клонированных генов, как уже отмечалось, не гарантирует успеха в таких экспериментах. Необходимым условием является реализация определенных механизмов, обеспечивающих опережающее по сравнению с рестриктазой действие метилазы на ДНК реципиентного штамма. Самым простым способом достижения этой цели могла бы быть опережающая экспрессия метилазного гена. Это может реализовываться или путем его опережающей транскрипции и (или) трансляции или какими то другими механизмами. В литературе отсутствуют генетические данные о существовании регуляторных генов контролирующих экспрессию генов rm II типа. Для генов rm предполагается конститутивная экспрессия. Однако, конститутивная их экспрессия не исключает возможности наличия механизмов контролирующих ее уровень.
Данные представленные на рис. 2 убеждают в том, что гены системы rm значительно различаются по своей организации. Единственной общей чертой, выявленной среди охарактеризованных систем, оказалось тесное сцепление генов, которые могут располагаться во всех возможных вариантах, как в отношении их последовательности (rm, mr), так и во взаимной ориентации направления транскрипции (тандемная, конвергентная и дивергентная). Разнообразие организации генов rm могло бы указывать на разновариантность способа координации их экспрессии в разных системах rm. Наличие сведений о первичной структуре генов rm позволило приступить к анализу этого вопроса. Очевидно, что оперонная модель транскрипции блока генов rm может реализовываться только в случае их тандемного расположения. Таким образом организовано семь рассматриваемых систем (более половины среди исследованных) это гены PaeR7, Hha II, Taq I, EcoR I, Dde I, BsuR I и Dpn II (см. рис 2).
Оперонный вариант транскрипции предположительно имеет место в случае генов rm PaeR7 [143,370]. Этого и следовала ожидать, так как данные о первичной структуре свидетельствуют, что между генами метилазы и рестриктазы (расположенных в указанном порядке) не имеется никакого промежутка (сразу же за терминаторным кодоном ТАА в гене метилазы идет инициаторный кодон ATG гена рестриктазы). Расположение m гена перед г геном предполагает опережающую экспрессию первого. Кроме того наличие аналогов канонических —35 и —10 последовательностей наблюдается только перед геном метилазы. Делеционный анализ показал, что ступенчатое удаление 34 нуклеотидов в районе —35 области, расположенной в 5’ направлении от точки инициации m гена, реализуется в постепенном скоординированном снижении экспрессии как проксимального (метилазного), так и, дистального (рестриктаз-ного) генов. Полное удаление —35 области приводит к полному прекращению синтеза метилазы и значительному (в 1000 раз) снижению уровня рестриктазы. Последний факт (наличие, хотя и слабого синтеза, рестриктазы) может быть объяснен выполнением очень слабой промоторной функции терминальной областью метилазного гена, хотя никаких аналогов —35 и —10 областей в ней не обнаружено. Здесь на расстоянии 5 нуклеотидов от инициаторного кодона гена-рестриктазы в частности выявлена последовательность 5’GGAG, частично перекрывающаяся с канонической для Е. coli SD последовательностью.
