Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Для генов RMSin I характерно конвергентное расположение [199]. В этом случае очевидно, что транскрипция составляющих компонентов должна происходить с отдельных промоторов. В соответствии с этим перед обоими генами были обнаружены типичные —35 и —10 последовательности. Перед обоими структурными генами также имеются элементы SD последовательностей.
Дивергентная организация генов обнаружена в случае RMPst I и EcoRV (см. рис. 2). Они разделены 130 и 306 нуклеотидными парами соответственно. В обоих случаях в общей области разделяющей составляющие гены наблюдаются типичные промоторные последовательности. Гены транскрибируются с разных промоторов и с разных цепей ДНК. В случае RMPst I было показано, что начало транскриптов разделяет всего лишь 70 нп. В связи с тем, что РНК полимераза Е. coli покрывает 40—50 нп начиная от точки инициацииiтранскрипции [385], не исключено перекрывание ею обоих промоторов. Экспериментально доказано, что in vitro полимераза имеет более сильное сродство к промотору метилазного гена. Сказанное предполагает преимущественную транскрипцию m гена и может объяснить тот факт, что, как установлено, этот ген экспрессируется более сильно, чем ген рестриктазы.
Резюмируя вышеизложенную информацию следует еще раз подчеркнуть, что ее интерпретация является однозначной в случае наличия или отсутствия сигналов инициации транскрипции и SD последовательностей гомологичных таковым Е. coli. Вместе с тем очевидно, что экспрессия гетерологичных по таксономическому происхождению для этих клеток генов в не-
которых случаях происходит даже в отсутствии сигналов транскрипций характерных для Е. coli. Такое же заключение правомочно и для SD последовательностей, структура которых имеет отношение к экспрессии генов на уровне трансляции [324,348]. Эти выводы имеют прямое отношение к вопросу о влиянии барьера гетерологичной экспрессии на исход опытов по клонированию генов гш.
Влияние вторичной структуры иРНК генов гш на их экспрессию обсуждалось только в нескольких случаях [88,206]. Наиболее подробно этот вопрос рассмотрен в случае иРНК рестриктазы EcoRV [88]. Оказалось, что за терминаторным кодоном в составе иРНК находится GC богатая область протяженностью в 110 нуклеотидов, содержащая несколько инвертированных повторов. Согласно расчетам их наличие позволяет образоваться нескольким стабильным двухспиральным структурам с одноцепочечной петлей, характерным для сигналов тер-минации транскрипции. Петля, входящая в состав одной из рассматриваемых структур, содержит последовательность из 7-ми нуклеотидов комплементарных с последовательностью, включающей и окружающей инициаторный кодон, что может привести к образованию дуплекса в этой области иРНК. Если предсказанная на основании расчетов структура действительно реализуется, то это могло бы привести к прекращению инициации трансляции сразу после синтеза полной последовательности иРНК- Таким образом трансляция могла бы осуществляться только в ходе транскрипции. Аналогичные структуры не выявлены в случае метилазной иРНК. Поэтому можно предположить, что в случае клонирования генов RMEcoR V этот механизм регуляции обеспечивает опережающую экспрессию метилазного гена.
В случае генов RMPst I отмечается наличие в составе иРНК, расположенных за терминаторным кодоном последовательностей, способных образовать шпилечные структуры [385]. Вопрос об их участии в регуляции экспрессии остается открытым.
В случае конвергентно ориентированных тесно сцепленных генов RMSin I, разделенных всего 31 нп, выдвинуто предположение о наличии в этой области общего терминатора транскрипции. Действительно такая последовательность, предположительно способная образовывать терминаторную шпилечную структуру с петлей, окруженная АТ богатыми участками, в межгенной области имеется. Последовательности, способные давать шпилечные структуры в иРНК, имеются и за геном MBsuRI [206].
Анализ многих генов Е. coli показал, что они различаются по частоте использования синонимных кодонов [78,381]. Кроме того была выявлена корреляция между этим показателем и силой экспрессии генов, регулируемой на уровне трансляции. Обсуждаемый механизм регуляции обеспечивается таким обра-
зом, что в сильно экспрессируемых генах кодонный состав коррелирует с наиболее представленными в количественном отношении в клетке изоакцепторными для отдельных аминокислот видами иРНК [78,381]. Синонимные кодоны, содержащие в третьем положении G/С, характерны для сильно экспрессируемых генов, обратная закономерность характерна для кодонов, содержащих в этом положении А/Т. АТ состав ДНК влияет на кодонный состав [151].
АТ состав ДНК Е. coli равняется 49% [88,148,277]. Этот показатель для генов RMEcoR I и RDEcoR V равняется 65% и 65,3% соответственно [88,148,277], что может быть связано или с особенностями организации этих локусов, определяющими уровень их экспрессии, или с их эволюционным происхождением из таксонов с таким АТ содержанием. Высокое АТ содержание характерно и для ряда других RM генов. Оно равняется 68,4%—RBsuR I, 61,9%—MBsuR I (АТ содержание ДНК В. subtilis равно 57%) [206], 63% — RMDde I (43% — ДНК Desulfovibrio desulfuricans) [365], 62% —RPst I и 68% — MPst I [385]. Другие гены no AT составу не так сильно отличаются от характерного для Е. coli: 52% — RTaq I, 59% —
