Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Количество рестриктазы PaeR7 в клетках значительно превышает таковое метилазы [370]. В связи с тем, что эти гены входят в состав оперона и предположительно котранскриби-руется уровень их экспрессии вряд ли контролируется механизмами транскрипции. Поэтому причину наблюдаемого явления следует искать в разнице эффективности трансляции сравниваемых генов. Действительно перед геном m не имеется последовательности SD, которая наблюдается на расстоянии 3—9 нп от инициаторного кодона гена эндонуклеазы. Кроме того не исключено, что наличие в составе метилазного гена редко используемого инициаторного кодона GTG, вместо обычного ATG, сказывается на эффективности трансляции соответствующей иРНК.
Анализ структуры генов RMPaeR7 указывает на возможность существования и других уровней контроля экспрессии, а именно на уровне использования кодонов. Согласно этому показателю гены RMPaeR7 близки к сильно экспрессируемым генам Е. coli.
Гены RMHha II, относящиеся согласно принципу их организации к тандемно расположенным в порядке М »-R—-> разделены 21 нп f347]. Предположительно они могут образовать оперон. Элементы Прибнов бокса удалось обнаружить только перед метилазным геном ни перед одним из генов не имеется.
элементов канонической для Е. coli —35 области. Показана зависимость одновременной экспрессии обоих генов от ориентации клонированного фрагмента, содержащего гены RMHha II, относительно векторных промоторов. Вместе с тем эти данные не противоречат предположению о функционировании генов RMHha II в Е. coli — в виде оперона. Реализуется ли в Н. haemolyticus — источнике генов, вопрос остается открытым.
Относительно варианта реализации транскрипции генов
RMTaq I, расположенных в порядке М-------->-R—»- на расстоянии
135 нп делать определенные выводы оказалось невозможным [3501. Перед ними не удается обнаружить последовательностей, характерных для промоторов Е. coli. SD последовательность обнаружена только перед г геном. Показано, что ген метилазы экспрессируется с векторных последовательностей, а последовательности необходимые для транскрипции гена рестриктазы расположены в метилазном гене. Поэтому в данном случае экспрессия этих генов в Е. coli скорее всего реализуется не с промоторов характерных для Т. aquaticus, продуцента RMTaq I. Относительно большое расстояние между этими генами позволяет предположить, что они в клетках Т. aquaticus транскрибируются раздельно.
В случае генов RMTaq I вопрос о скоординированной их экспрессии при клонировании в Е. coli, в отличие от подавляющего большинства других исследованных систем рестрикции-модификации, неожиданно оказался неактуальным. Клетки, содержащие рестриктазу остаются жизнеспособными и в отсутствие модифицирующего фермента.
Интересной особенностью обсуждаемой системы рестрикции^ модификации является неравномерное распределение Taq I сайтов между генами. В гене рестриктазы их имеется 7, а метилазы — ни одного, что является статистически достоверным отклонением от предсказуемого их распределения. Высказывается предположение, что такое расположение Taq I сайтов имеет какую-то регуляторную функцию. Возможный механизм такой регуляции мог бы заключаться во взаимодействии эндонуклеазы с незащищенными метилированием Taq I сайтами в гене рестриктазы, что исключило бы его транскрипцию. Тем самым был бы прекращен синтез фермента до тех пор пока клеточная ДНК Т. aquaticus не подверглась бы модификации по всем незащищенным сайтам. Такой механизм мог бы играть определенную роль в ходе установления RMTaq I в новом хозяине и придал бы клеткам способность выживать в случае вариации степени метилирования ДНК-
Исследование других клонированных генов гш показало, что аналогичное распределение узнаваемых сайтов является нехарактерным. Поэтому ауторестрикция не может явиться общим механизмом регуляции экспрессии генов рестриктазы.
Система RMDpn II отличается необычной для ферментов II типа генетической организацией [119,2211. Она включает 3 гена. Гены транскрибируются тандемно в следующем порядке: dpnM (метилазный), dpnA (метилазный) и dpnB (эндонукле-азный) (см. рис. 2). Кодирующие области первого и второго генов перекрываются на 8 нп, второго и третьего — на 11 нп. Характерные для —35 и —10 областей последовательности удается обнаружить только перед dpnM геном. SD последовательность, имеющая элементы гомологии с канонической для Е. coli имеется перед dpnB геном. Перед dpnM и dpnA продемонстрировано наличие типичных последовательностей, которые отличаются от структуры SD [1191. Их структура приведена а табл. 21. Предполагается, что они выполняют функцию SD последовательностей как в грамположительных, так и в грам-отрицательных микроорганизмах [119].
ДНК модифицирующую защитную функцию выполняет продукт гена dpnM. Функция второй метилазы, кодируемой геном dpnA не выяснена. Учитывая его перекрывание с эндо-нуклеазным и метилазным генами, для dpnM предполагается регуляторная роль на уровне трансляции или транскрипции [ 1191.
Гены RMDpn II были успешно клонированы как в S. pneumoniae (гомологичный реципиент) [2211, так и в Е. coli [119]. Таким образом, эта система имеет элементы регуляции, проявляющие себя активно в клетках различной таксономической принадлежности.
