Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
MTaq I [3501, 58% — RMSin I [199]. Гены RMPaeR7 выделяются высоким GC содержанием, равным 60,8% (39,2% AT)
(370].
Согласно кодонному составу гены RMEcoR I [148,277], EcoR V [88], PstR I [385] и BsuR I [206] могут быть отнесены к слабо экспрессирующимся в Е. coli. В случае RMTaq I [350] он соответствует распределению, характерному для ДНК этого микроорганизма. Выделяется в этом отношении структура генов RMPaeR7, кодонный состав которых соответствует таковому сильно экспрессируемых генов кишечной палочки [370].
9.3. Гомология генов, кодирующих ферменты рестрикции-модификации
Исследования, посвященные определению первичной структуры генов рестрикции-модификации с самого начала не являлись самоцелью. Полученные данные послужили предпосылкой для поиска возможных гомологий структуры генов — наличия или отсутствия консервативных нуклеотидных (или выводимых из них аминоскислотных) последовательностей. Эти сведения являются необходимыми для решения таких вопросов как эволюция генов гш, определение участков белковых молекул ответственных за специфическое взаимодействие с субстратом и участвующих в формировании каталитического центра.
Сравнение нуклеотидных или аминокислотных последовательностей производится с помощью компьютерной (см. обзоры [65,118]) техники. В этом направлении в настоящее время работы проводятся во многих лабораториях.
Первой была секвенирована система EcoRI [148,277]. Анализ последовательностей показал, что рестриктаза и метилаза существенно различаются на уровне первичной структуры, несмотря на то, что оба фермента взаимодействуют с одной и той же субстратной последовательностью. В дальнейшем оказалось, что это характерно и для остальных исследованных случаев [88,109,199,350,356,382]. Возможно анализ на уровне вторичной или третичной структур позволит обнаружить общие структурные элементы, однако, все же более вероятно, чт» отсутствие гомологии указывает на различную природу механизмов взаимодействия сопряженных рестриктаз и метилаз с субстратом.
Другим, может быть и менее неожиданным, результатом сравнения является отсутствие заметной гомологии среди рестриктаз [109,199,382], даже между ферментами с близкими характеристиками субстратной специфичности как, например, RPaeR7 I (5’С *TCGAG) и RTaq I (5’*TCGA) [350]. В то же время иммунологическими методами обнаружено сходство изошизомеров Rsr I и EcoR I на уровне третичной структуры [147]. К настоящему моменту также проведено определение 34 N-концевых аминокислот RRsr I и обнаружена значительная гомология с REcoR I. Данные по первичной структуре генов RMRsr I пока отсутствуют, что исключает возможность сравнения ее с этой характеристикой генов RMEcoR I.
В случае метилаз прослеживается иная картина. В результате систематических исследований бактериальных и фаговых метилаз, образующих т5С, разным авторам удалось выявить от трех до одиннадцати гомологичных районов, разделенных ва-риабильными участками [74, 109, 117, 147, 199, 217, 356]. Так, неотъемлемой частью этих ферментов являются аминокислотные фрагменты следующего состава: ENVK, Q—R—R, (D, N) — ---------G—PC и др. Имеются экспериментальные и теоретические доводы, позволяющие предположить, что остаток цистеина фрагмента PC, как и в случае тимидилат синтетазы, активирует С5-атом цитозинового ядра путем ковалентного присоединения по Сб-положению [286,400].
Сравнение некоторых изометимеров (метилаз, узнающих идентичные нуклеотидные последовательности) позволило в вариабельных участках выделить схожие последовательности, которые, как предполагается, ответственны за узнавание субстрата [74,361]. Методами сайт-специфического мутагенеза показано, что в мультиспецифических фаговых метилазах эти последовательности являются непрерывными участками длиной 40—50 аминокислот, расположенными тандемно [72, 74, 153, 395]. Таким образом, вариабельность специфичности метилаз обеспечивается комбинациями узнающих участков в главном остове, в котором сосредоточены узлы связывания Адо-мет и введения СН3-группы в 5-ое положение цитозина.
В группе адениновых метилаз также прослеживается, хотя й менее явная, но вполне осязаемая общность в структурной организации. Все изучавшиеся адениновые метилазы имеют последовательность (D, N)PPY, причем для ферментов, обладающих сходной или близкой субстратной специфичностью, выявлены дополнительные районы гомологии [109,156,228,270]. Констатируется также некоторое сходство этих ферментов с группой С5-цитозиновых метилаз [228]. Последовательность единственной пока секвенированной т4С метилазы Pvu II имеет больше элементов сходства с известными Ыб-адениновыми, чем с С5-цитозиновыми метилазами [367].
Детальное исследование интер- и интрамолекулярных гомологий в ряду мётилаз позволило сделать предположение о возможном филогенетическом пути эволюции метилаз. По мнению Р. Лаустера [227], метилазы сформировались в результате одной или двух дупликаций гена белка-предшественника в 12— 16 КД, с последующей дивергенцией, приведшей к наблюдаемому в настоящее время многообразию ДНК-метилирующих ферментов. Аналогичный, однако, независимый путь эволюции предлагается и для рестриктаз.
