Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Исследователи [12, 19] предполагают, что рестриктаза EcoR II (5'CC(A/T)GG) имеет контакты (или сближение) с 5-Н атомами обеих цитозинов в цепи содержащей Т, и внутреннего цитозина в цепи, содержащей А. Этот вывод является следствием результатов гидролиза замещенных по этим положениям 5-метил-и 5-бромцитозин субстратов. Полное ингибирование или резкое замедление расщепления этих ДНК-Дуплексов объясняется, (в случае модификации внутренних цитозинов обеих цепей), исключительно стерическим эффектом метильной группы (ковалентный радиус в 2 раза превышает радиус водорода, а Ван-дер-ваальсовый радиус—в 1,7 раза), а в случае 5'-концевого цитозина цепи содержащей Т, — образованием непродуктивного комплекса [410]. Кинетические параметры показывают, что он
отличается большой прочностью и высоким значением То,5 (период полураспада комплекса). Как видно, это не является достаточным условием для успешного протекания ферментативной реакции.
Рестриктаза Mva I (5'СС (A/T) GG) нечувствительна к модификации С5 положения обоих цитозинов в своем сайте [19, 215]. Замена С в одной или в обеих цепях на т5С не влияет на скорость расщепления модифицированного субстрата, а значения Км для Т- и A-цепей такого дуплекса почти не отличаются от Км этих же цепей канонического дуплекса, что указывает на беспрепятственное формирование фермент-субстратного комплекса [215]. Все это свидетельствует об отсутствии непосредственных контактов рестриктазы Mva I с 5-Н атомом обоих цитозинов в участке узнавания [29].
Получены данные, что как EcoR II, так и Mva I (изошизомеры узнающие 5'СС (A/T) GG) не расщепляют субстратов, в которых метилирована экзоциклическая NH2 группа внутреннего цитозина [103]. Также установлено, что метилирование экзоцик-лической аминогруппы 5'-концевого цитозина препятствует расщеплению модифицированной цепи гемиметилированного ДНК-дуплекса рестриктазой Mva I (5'СС (A/T) GG), а немодифициро-ванная цель расщепляется достаточно эффективно [29]. Значит, для этого фермента наличие контакта с 4-NH2 группой внешнего цитозина в одной из цепей субстрата необходимо для расщепления только этой цепи ДНК-дуплекса, а гидролиз другой цепи протекает независимо от наличия или отсутствия этого контакта.
В аналогичных экспериментах было показано, что эндонуклеаза EcoR II и меет контакты с экзоциклическими аминогруппами 5'-концевых цитозинов в обеих цепях, так как введение т4С в одну из цепей блокировало расщепление обеих цепей [29].
В случае рестриктаз AIu I (5'AGCT), Pvu II (5'CAGCTG) и Cfr6I (5'CAGCTG) было установлено, что замена цитозина в составе 5'AGCT на mSC или т4С исключало расщепление субстратов указанными ферментами [102].
Рестриктазы Bgl II (5'AGATCT), Sau3A I (5'GATC), Mbo I (5'GATC), Mfl I (5'PuGATCPy) не расщепляют гомодуплексы, содержащие m5C (в составе 5'GATC) в участках узнавания соответствующих ферментов [284]. Bgl II и Sau3AI также не гидролизуют ни одной цепи гетеродуплекса, содержащего это основание. Рестриктазы Mbo I и Mfl I расщепляли обе цепи, но с различной скоростью. Mbo I расщепляла быстрее немодифици-рованную, a Mfl I — модифицированную цепь. Это указывает на расщепление дуплекса способом, в котором рестриктаза связывается с одной цепью, а расщепляет другую. Как видно, реет-, риктазы Bgl I и Sau3A I имеют тесные контакты с 5Н атомами
цитозинов своего участка узнавания, а для Mbo I и Mfl I эти контакты не являются необходимыми.
Расщепление субстратов рестриктазами Bgl II, Sau3AI, Mbo I, Mfl I блокировалось и при введении метильной группы в М4-положение (как и в случае С5-метилирования цитозина)
[284]. Метилирование аминогруппы цитозина в одной цепи гетеродуплекса полностью ингибировало расщепление этой же цепи рестриктазами Bgl II, Sau3AI и обнаруживалось только следовое расщепление немодифицированной цепи. Рестриктазы Mbo I и Mfl I расщепляли обе цепи субстрата, только с различными скоростями (это указывает на способ расщепления, обсужденный выше).
Интересными свойствами обладает рестриктаза Msp I (5'CCGG). Ее действие блокируется введением метильной группы в С5 положение наружных цитозинов узнаваемого участка [105]. Однако она, хотя и замедленно, расщепляла субстраты содержащие в этом положении т4С. Изучение взаимодействия RMsp I с гемиметилированным субстратом показало, что в гетеродуплексе m5CCGG : CCGG модифицированная цепь расщепляется более эффективно. То же самое было отмечено и в случае гетеродуплекса m4CCGG: CCGG. В этом отношении RMsp I напоминает рассмотренные выше RMbo I и Mfl I.
С целью изучения чувствительности RM ферментов к разным вариантам модификации цитозина на примере рестриктаз Msp I (5'CCGG), Нра II (5'CCGG), Smal (5'CCCGGG), Xma I (5'CCCGGG), Cfr9 I (5'CCCGGG) было проведено систематическое исследование влияния метилирования цитозинов, расположенных в разных местах узнаваемого участка, по С5 положению или 4NH2 группе [105]. Было установлено, что т4С, как правило блокирует действие большинства исследованных ферментов. Ингибирующий эффект т5С выражен значительно слабее.
