Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Янулайтис А.А. -> "Биотехнология. Том 17" -> 42

Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.

Янулайтис А.А. Биотехнология. Том 17 — Москва, 1989. — 204 c.
Скачать (прямая ссылка): fermentiserekteciiiihpremenenie1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 36 37 38 39 40 41 < 42 > 43 44 45 46 47 48 .. 107 >> Следующая

Таким образом, можно сделать предварительный вывод, что 6-NH2 группа важна для проявления активности рестриктаз EcoRI [90], EcoR II [29], Mbo I [284] и Mva I [29], но совсем не обязательна для рестриктазы Sau3A I (5'GATC) (введение М6-метиладенина не препятствует гидролизу) [284]. Упомянутые рестриктазы Sau3A I и Mbo I узнают одинаковую последовательность нуклеотидов, одинаково расщепляют тот же сайт, поэтому можно сделать вывод о разных механизмах их действия.
Нужно отметить, что для рестриктаз не безразлично, в каком положении узнаваемого участка находится Ы6-метилиро-ванное основание аденина. Рестриктаза Bgl II (5'АЮАТСТ) расщепляет олигонуклеотид, несмотря на введение СН3-группы в среднее звено участка узнавания, но не расщепляет (хотя и хорошо связывается), если СН3-группа находится в левом
крайнем аденине [284]. Реетриктаза Mfl I (5ФиЮАТ€Ру) ведет себя противоположным образом.
Для более глубокого исследования значимости №-метили-рования центрального аденина в участке узнавания рестриктазы EcoR I, исследовалась его замена на 2-аминопурин (2-АР) [90]. Эта замена устраняет №-аминогруппу из большого желоба, но вводит NH2-rpynny во второе положение, экспонированное в малом желобе, которая образует водородную связь с 2-оксигруппой тимина. Для контроля в то же самое положение сайта вводили 2,6-диаминопурин (2,6 АР). Эта замена возвращает 6-NH2 группу в большой желоб с сохранением 2-NH2 группы в малом желобе. Оба олигонуклеотида расщеплялись ферментом (хотя и незначительно), из чего следует, что отсутствие 6-NH2 группы аденина в большом желобе (участвующей, как отмечалось, в образовании водородной связи с остатком глутаминовой кислоты в ферменте) не исключает специфического узнавания субстрата рестриктазой EcoR I и его расщепления. Видимо, отсутствие обычной водородной связи компенсируется благодаря взаимодействию фермента с другими группами участка узнавания [322]. Введение дополнительной метильной группы в любой аденин участка нежелательно, так как это препятствует взаимодействию и полностью блокирует катализ [90]—это обсуждалось выше и объяснялось стерическими эффектами этой группы.
Роль 7-iN атома обоих аденинов в узнаваемом участке рестриктазы EcoRI (5'GAATTC), Сила и др. [337] определяли путем синтеза олигонуклеотидов, содержащих 2'-дезокситу-берицидин (отсутствует 7-N атом аденина) в разных положениях сайта узнавания. При замещении одного из нуклеотидов, образовались ожидаемые продукты реакции, хотя рестрикция была сильно замедлена. Замещение сразу обоих нуклеотидов приводило к ингибированию расщепления рестриктазой EcoR I.
Результаты рентгеноструктурного изучения кокристалла EcoRI — олигонуклеотид [137], указывают на участие 7-N атома обоих аденинов во взаимодействии в качестве акцепторов протонов соответствующего аминокислотного остатка фермента. Из этого авторы делают вывод о том, что фермент может приспособиться к отсутствию одной пурин-акцепторной связи, однако, если отсутствие двойное он становится неактивным по отношению к такому субстрату.
Важность 3-N атома среднего аденина в участке узнаваемом рестриктазой Bgl II (5'AGATCT) была установлена с помощью декануклеотида, в котором обсуждаемое основание заменено на 3-деазааденин (отсутствует 3-N атом) [285]. Рестриктаза Bgl II была неспособной расщепить такой субстрат, хотя связывание с исследуемым декамером не было нарушено [285].
Проведение эксперимента с этим же субстратом и рестрик-тазами Mbo I (5'GATC) и Sau3A I (5'GATC) показало, что
обе они слабо гидролизировали модифицированные субстраты [285]. Авторы обсуждаемой публикации делают вывод, что эти ферменты взаимодействуют с малым желобом ДНК, а замедление расщепления объясняется изменением способа их связывания с модифицированным субстратом.
7.1.2. Тимин
Наиболее хорошо исследовано образование гидрофобного контакта рестриктаз с 5-метильной (5-СНз) группой тимина (Т), расположенной в большом желобе [12, 90, 127, 215, 377,
410]. Рестриктазы по разному реагируют на присутствие этой группы в своем сайте, например, для активности EcoR II [12, 19, 410], Hpa I [127] эта группа является необходимой, а для Mva I она не имеет значения [215].
Роль 5-СН3 группы во взаимодействии эндонуклеаз рестрикции с ДНК исследуется при помощи олигонуклеотидов, содержащих участки узнавания соответствующих рестриктаз, в которых тимин заменен на урацил (U) [90, 215, 377], 5-бромура-цил (5BrU) [90, 127, 377, 410] или 5-фторурацил (5flU) [12, 215]. Замена тимина на урацил устраняет 5-СН3 группу из большого желоба и замещает ее на атом водорода (5-Н). В случае исследования взаимодействия с субстратом рестриктазы EcoR I (5'GAATTC), внутренний Т в сайте узнавания был заменен на U. Расщепление такого субстрата происходило наравне с каноническим, однако при замене внешнего Т, расщепления не наблюдалось [90]. Соответствующая замена Т на 5BrU приводило к ускорению гидролиза в первом случае и к незначительному расщеплению во втором случае [90]. Исходя из этих данных, делается вывод о том, что 5-СНз группа внутреннего Т не является важным контактом (хотя Km этого субстрата указывает на ее участие в связывании с ферментом). Напротив эта же группа внешнего Т существенно влияет на взаимодействие с рестриктазой EcoR I.
Предыдущая << 1 .. 36 37 38 39 40 41 < 42 > 43 44 45 46 47 48 .. 107 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed