Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Янулайтис А.А. -> "Биотехнология. Том 17" -> 45

Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.

Янулайтис А.А. Биотехнология. Том 17 — Москва, 1989. — 204 c.
Скачать (прямая ссылка): fermentiserekteciiiihpremenenie1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 39 40 41 42 43 44 < 45 > 46 47 48 49 50 51 .. 107 >> Следующая

Обобщая полученные результаты чувствительности рестриктаз к т4С и т5С можно сказать, что ферменты могут дифференцировать оба положения и проявлять различную чувствительность к соответствующим основаниям. Объяснение этому можно искать, анализируя расположение этих метильных групп в двойной спирали ДНК. По этому признаку метилирование ^-положения существенно отличается от такого по С5. Хотя обе метальные группы находятся в большом желобе В-ДНК, №-метильная группа находится в центральной, т. е. наиболее выступающей части желоба, а С5 — в боковой. В дополнение, метилирование цитозина по Ы4-положению создает не только стерические затруднения при взаимодействии с ферментами, что возможно имеет место и в случае С5-метилирования, но также блокирует ЫНг-группу — важный контакт опознавания С : G пары, находящийся в большом желобе ДНК.
Следует отметить, что т4С в отличие от т5С в составе дуплексов дестабилизирует двойную спираль ДНК [104].
Вероятно, что рассмотренные выше различия в основном и обуславливают более сильный ингибирующий эффект Ы4-метил-цитозина в отношении действия ферментов.
Результаты рассмотренных экспериментов свидетельствуют что 4-NH2 группа цитозинов в участке узнавания соответствующих ферментов играет важную роль во взаимодействии. Наблюдаемое снижение скорости или отсутствие расщепления, если в это положение введена СН3-группа, свидетельствует о потере способности 4-NH2 участвовать в образовании водородной связи с белком, или о стерическом препятствовании СНз-группы сближению модифицированного субстрата с ферментом или гидролизу олигонуклеотида.
7.1.4. Гуанин
Наиболее исследованными точками контакта гуанина [146] с ферментами являются 2-аминогруппа (2-NH2) (малый желоб) и атом азота в положении 7 (7N) (большой желоб).
Значение 2-NH2 группы гуанина исследовано путем ее метилирования [285] или ее удаления путем замены G на гипоксантин (I) [29,90,127,285]. Последний путь применяется наиболее часто. Изучено взаимодействие рестриктаз EcoR I [90], EcoR II [29], Bgl II [285], Нра I [127], Sau3A I
[285], Mbo I [285], Mva I [29] с модифицированными таким образом синтетическими субстратами.
Установлено, что для активности рестриктаз EcoR I (5’GAATTC) [90], EcoR II (5*CC(A/T)GG) [29], Mbo I (5’GATC) [285], Mva I (5’CC(A/T)GG) ![29] 2-NH2 группа не является обязательной, так как скорость гидролиза модифицированного ДНК-фрагмента практически не снижается. В случае EcoR II и Mva I имеются данные о гуанине, соседнем с центральным тимином. Данные о значимости правого крайнего гуанина участка узнавания этих рестриктаз отсутствуют. Исследование влияния модификаций по 7-N положению G, показали что все рассмотренные выше рестриктазы являются чувствительными к ним.
Ряд рестриктаз Нра I (5’GTTAAC) [127], Bgl II (5’AGATCT) и Sau3A I (5’GATC) [285] требуют контакта' (или сближения) с 2-NH2 группой для акта связывания и (или) расщепления. Подтверждением этому служит отсутствие расщепления соответствующих модифицированных субстратов. Из этих данных следует вывод, что для этих ферментов контакты с малым желобом ДНК играют важную роль.
Спектры КД и кривые Тш додекануклеотидов, содержащих метальную группу в 2-NH2 положении гуанина указывают на то, что СН3-группа увеличивает Тт дуплекса, тем самым стабили-
зируя форму ДНК. Возможно, она усиливает «стэкинг» взаимодействие гуаниновых оснований [285]. Удаление 2-NH2 группы из малого желоба вызывает изменения в конформации ДНК [90, 137]. Логично ожидать, что все эти замены, связанные с влиянием на конформацию ДНК, могут снижать или даже блокировать расщепление субстрата рестриктазами.
Акцептор протонов 7N положение гуанина (большой желоб) является точкой контакта для рестриктазы EcoR I [137], которая очень слабо гидролизует ДНК-фрагмент, если произведена замена гуанина узнаваемого участка на 7-деазагуанин [336].
Завершая обсуждение роли отдельных групп атомов гетероциклических оснований в специфическом взаимодействии рестриктаз с субстратом следует еще раз отметить, что обычно результаты об изменении их активности (или полном ее отсутствии) вследствие введения в основание дополнительных химических групп или при их удалении, интерпретируются как указание на близкое расположение или взаимодействие фермента с соответствующей группой во время реакции. Кроме того, для получения более достоверной картины, следует учитывать влияние модификаций субстрата на конформационные изменения ДНК, а также на превращения, которые могут быть необходимыми для прочного связывания ферментов и для катализа реакции расщепления.
7.2. Влияние нуклеотидных последовательностей, фланкирующих участок узнавания
Как уже отмечалось, рестриктазы взаимодействуют не только с сайтами узнавания, но и с прилегающими участками. Существуют определенные требования к фланкирующим последовательностям (длина и природа) для обеспечения эффективного взаимодействия. Надо отметить, что эти требования индивидуализированы для разных рестриктаз [3, 4, 12, 73, 224, 407, 408,
Предыдущая << 1 .. 39 40 41 42 43 44 < 45 > 46 47 48 49 50 51 .. 107 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed