Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Состояние протопластов и дальнейшая их судьба во многом зависят от состава, концентрации и времени действия ферментов. Выбор их основан на структуре и строении клеточной стенки. Основными компонентами ферментной системы должны быть соеди-
нения, разрушающие целлюлозу, гемицеллюлозу и пектиновые вещества. Для этой цели подходят ферментные препараты, полученные из микроорганизмов и грибов.
Целлюлазный препарат Onozuka R-10 («Kinki Yakult», Япония), выделенный из Thrichoderma viride, является сложным комплексом целлюлаз, разрушающим сначала нативную и кристаллическую целлюлозу, а затем и аморфную. В состав этого фермента входят также целлобиоза, ксиланаза, пектиназа, липаза, а также различные нуклеазы. Целлюлазной активностью обладает также целлюлизин («Calbiochem», Швейцария), а гемицеллюлазной — дрейселаза («Kyowa, Hakko, Kogyo», Япония), полученная из актиномицетов, и целлюлаза из Aspergillus niger («Sigma», США), а также отечественные препараты ксиланазы, полученной из того же гриба, и ксиланигрина (Московский завод ферментных препаратов).
Применяют различные пектиназы — пектиназу («Sigma», США), пектиназу-500 и 1500 (Московский завод ферментных препаратов), а также мацерозим, полученный из Rhizopus («Kinki Yakult», Япония) и мацеразу («Calbiochem», Швейцария). Если применяемые ферменты не разрушают полностью компоненты клеточной стенки, то в качестве добавки используют препарат из пищеварительного сока улитки Helix pomatia. Коммерческий препарат называется геликазой («Ind. Biol. Fran$aise», Франция) и содержит более 30 индивидуальных целлюлитических энзимов.
Подбор ферментной системы производится на основании знаний об особенностях тканей и данных, имеющихся в литературе для тканей подобного типа данного или близкого вида.
Время выделения протопластов зависит от концентрации фермента. При больших концентрациях продолжительность инкубации составляет 1—4 ч, при невысоких—12—20 ч, оптимальные условия — pH 5—6, температура 23—26 °С. Иногда требуется слабое покачивание в течение периода инкубации с ферментом.
В результате обработки ткани ферментными препаратами получается смесь, содержащая протопласты, обломки тканей, разрушенные и целые клетки. Чтобы отделить протопласты от этих примесей, суспензию фильтруют через нейлоновый фильтр, а затем центрифугируют в мягких условиях.
Культивирование протопластов
Методы культивирования протопластов соответствуют тем, которые применяются для выращивания клеток. Протопласты высевают как на жидкие (табл. I и 2), так и на агаризованные среды того же состава с различными концентрациями агара. В табл. 1 и 2 приводятся наиболее часто используемые среды. Основное требование к применяемым средам состоит в том, чтобы в процессе культивирования не происходило разрушения протопластов и среда была оптимальна для образования клетками колоний. До тех пор пока протопласты не образовали клеточную стенку, они представляют собой очень нежные структуры и работу с ними нужно проводить в мягких условиях.
Состав Гамборг и Мурасиге и Нагате и Шейк и Хиль-
Эвелейт [8] Скуг [9] Такебе [10] дебраидт [И]
NaH2P04 Макрос ОЛИ 300
150
KNo3 ;. 3000 1900 950 , 2500
(NH4)2S04 134 --- --- • ---
MgS04- 7Н20 500 370 1233 500
СаС12- 2НаО 150 440 220 200
FeS04- 7Н20 27.25 27.85 27.8 27.85
Na2-EDTA 37.25 37.25 37.3 37.3
nh4no3 --- 1650 825 ---
кн2ро4 - 170 680 -
MnS04- н2о Микросоли 22.3 10
10 22.3
НзВОз 3 6.2 6.2 5
ZnS04- 7Н20 2 8.6 8.6 1
Na2Mo04- 2Н20 0.25 0.25 0.25 0.1
CuS04- 5Н20 0.025 0.025 0.025 0.2
СоС12- 6Н20 0.025 0.025 0.03 0.1
KI 0.75 0.83 0.83 1
Са-пантотеийт Витамины 5
1 1
Никотиновая кислота 1 --- --- 5
Тиамин 10 1 1 5
Пиридоксин 1 1 --- 0.5
Инозит 100 100 100 ' 100
j: . • Гормоны
Кинетии --- 5 --- 0.1
НУ к --- 1 3 ---
