Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
В 1-е сутки культивирования некоторое число протопластов погибает, что может быть связано с гетерогенностью популяции по отношению к действию осмотиков. Оставшиеся уже через несколько часов начинают синтезировать клеточную стенку. Полностью этот процесс завершается при правильно подобранных условиях выделения и культивирования через 1—4 сут. При этом протопласты теряют сферическую (форму, клетки удлиняются. Скорость регенерации клеточной стенки зависит от вида растения и ткани, из которой получены протопласты, а также от степени ее дифференцировки.
При неблагоприятных условиях выделения и культивирования протопластов образуется клеточная стенка не по всей их поверхности. В местах разрывов часть цитоплазмы выходит, оставаясь окруженной плазмалеммой. В ней могут находиться вакуоли. Это так называемые почки. «Почкование» происходит при повышенной концентрации осмотически активного вещества в присутствии неподходящего для данной культуры сахара, при низком содержании СаСЬ и др.
При правильно подобранных условиях выделения и культивирования к 3—4-м суткам с момента высева наблюдаются первые деления протопластов. В большинстве случаев затем образуются многоклеточные агрегаты, развивающиеся в дальнейшем в каллус, способный регенерировать целое растение. Растения-регенеранты из протопластов получены для люцерны, табака, моркови, томата и целого ряда других.
Процедура выделения
и культивирования протопластов
Работа с протопластами требует стерильных условий;и следующего оборудования: 1) стерильная комната — бокс или* ламинар-бокс; 2) инвертированный микроскоп; 3) центрифуга, способная давать небольшое число оборотов; 4) аппарат для стерилизации растворов, имеющий фильтр с размерами пор 0.2—0.45 мкм, задерживающий бактерии; 5) автоклав; 6) газ или спиртовая горелка; 7) пинцеты глазные и хирургические; 8) скальпели; 9) пинетки на 1, 2 и 5 мл, градуированные; 10) чашки Петри» диаметром 50—60 мм; 11) стерильные колбы Эрленмейера на 50 и 100 мл; 12) центрифужные пробирки; 13) центрифужные стаканы со вкладышами; 14) матрас из крафта с вложенными в него листами фильтровальной бумаги; 15) стеклянные воронки с вложенными в них нейлоновыми фильтрами, размер пор 60 мкм; 16) качалка с контролируемыми параметрами качания; 17) колбы на 1 л для стерилизации воды; 18) стаканы (3 шт.) на 500—800 мл для стерилизации и промывания водой листьев растений; 19) парафилм; 20) карандаш или фломастер по стеклу; 21) штатив для пробирок; 22) камера Фукса—Розенталя; 23) вата; 24) спирт 70 и 96 %-ный.
Протопласты из листьев растений. Для выделения протопластов из мезофилла листа берут растения определенного возраста, например при получении протопластов из листьев табака — 50—60-суточные растения, из листьев бобов — 14—18-суточные. Важно, чтобы все работы проводились в стерильных условиях. Ферментные растворы готовятся непосредственно перед использованием и стерилизуются через бактериальный фильтр. Посуда стерилизуется сухим жаром при 180 °С в течение 1 ч. Матрас автоклавируют при 2 атм в течение 1 ч, так же стерилизуется и дистиллированная вода. Инструменты можно стерилизовать при 120 °С или прожигать несколько раз над горелкой, предварительно помещая их в 96 %-ный спирт. Стол и вся стеклянная посуда предварительно протирается 70 %-ным спиртом. Все растворы дважды стерилизуются в автоклаве при 0.7—0.8 атм в течение 15 мин.
Процедура получения протопластов: 1) листья табака промывают проточной водой, затем споласкивают дистиллированной; 2) помещают их в стакан с 70 %-ным спиртом на 0.5—1 мин; 3) затем на 3—5 мин помещают в раствор 0.1 %-ного диацида (666 мг цетил-пиридиний хлорида, 333 мг этанолмеркурий хлорида и 1 л дистиллированной воды); 4) трижды по 10 мин промывают стерильной дистил-
,/
лированной водой, разлитой в стаканы емкостью 500—800 мл; 5) помещают в матрас на фильтровальную бумагу нижним эпидермисом вверх; осторожно с помощью скальпеля и глазного пинцета снимают эпидермис, разрезают на небольшие кусочки шириной 5—10 мм и помещают в раствор фермента (0.5 М маннит+0.5 %-ная целлюлаза (Onozuka R-10), pH 5.5—5.7), разлитый по 10 мл в 100 мл колбы Эр-ленмейера (стерильные) так, чтобы ткань плавала на поверхности фермента и не тонула; при этом та часть листа, с которой удален ц эпидермис, должна контактировать с ферментным раствором; 6) кол-т ( бы закрывают ^резиновыми пробками и ставят в темноте при 25 °С , на 13—15 ч во влажную камеру; 7) по истечении этого времени под инвертированным микроскопом оценивают качество и общее количество выделившихся протопластов; 8) начинают отмывать от фермента, если выделилось достаточное число протопластов и они имеют правильную сферическую форму с равномерно расположенными в них хлоропластами; 9) с помощью пипетки пропускают суспензию через нейлоновый фильтр в стеклянные колбочки или сразу же в центрифужные пробирки; 10) закрывают пробирки стерильными пробками и центрифугируют при 100 g в течение 3 мин, протопласты садятся на дно пробирки; 11) осторожно отбирают пипеткой надосадочную жидкость и добавляют 7—8 мл 0.4 М ман-нита; 12) затем центрифугируют в тех же условиях, операцию отмывки протопластов повторяют дважды; 13) пипеткой отбирают раствор маннита и добавляют 1—2 мл среды, на которой впоследствии будут культивировать протопласты; 14) в чистую стерильную пробирку набивают 0.9 мл среды и 0.1 мл получившейся суспензии протопластов; 15) в камере Фукса—Розенталя определяют число протопластов в мл; 16) на предметном стекле с помощью 0.01 %-ного раствора синьки Эванса или 0.1 %-ного эозина, приготовленных на соответствующем осмотически активном веществе, определяют процент живых протопластов и делают поправку к тому, что было просчитано в камере Фукса—Розенталя; 17) в стерильной пробирке исходную суспензию разводят средой так, чтобы конечное число клеток составляло (1—4) • 104 на 1 мл, и по 2 мл разливают в чашки Петри диаметром 50—60 мл; 18) заклеивают чашки пара-филмом и культивируют в темноте при 25 °С, наблюдая под инвертированным микроскопом за развитием протопластов каждые сутки.
