Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
В результате гибридизации удается получать гибриды клеток с хозяйственно ценными свойствами. Пока практически единственный пример таких гибридов — это гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела [6]. Однако можно ожидать создание линий гибридных клеток, обладающих способностью продуцировать другие ценные биологические вещества. Получение таких линий может быть достигнуто путем слияния дифференцированных клеток-продуцентов ценных веществ с опухолевыми клетками, имеющими такое же происхождение, что и клетки-продуценты.
Методы слияния клеток
Слияние клеток — процесс, в некоторых случаях происходящий в естественных условиях (слияние отдельных амебоидных клеток и образование синцития у миксомицетов, образование многоядерных мышечных клеток и остеокластов у позвоночных). Спонтанное слияние клеток в культуре [7] происходит с низкой частотой и не может быть использовано в опытах по гибридизации клеток.
Эффективным является метод слияния клеток с помощью инактивированного вируса Сендай [8]. Господство этого метода в области гибридизации клеток пришлось на вторую половину 60-х и первую половину 70-х годов. Преимущества вируса Сендай как сливающего агента заключаются в практически полном отсутствии цитотоксиче-ского эффекта, недостатки — в необходимости наращивать, титровать, концентрировать и инактивировать вирус, а также в неприменимости данного метода слияния к клеткам растений и грибов, которые не имеют рецепторов к вирусу Сендай.
Полиэтиленгликоль (Г1ЭГ) был впервые применен как сливающий агент к растительным клеткам [9]. Вскоре было показано, что поли-этиленгликоли с молекулярной массой 1000—6000 успешно сливают клетки животных [10]. Главный недостаток ПЭГ — высокая токсичность. В связи с этим время контакта клеток с ним стараются ограничить 1 мин. Предложен способ слияния, заключающийся в многократных очень коротких (по 1 с) обработках клеток 50 %-ным раствором ПЭГ с последующим переводом клеток в 25 %-ный раствор, затем в культуральную среду и снова в 50 %-ный раствор ПЭГ [11]. Клетки, находящиеся на покровных стеклах, переносятся таким образом из 50 %-ного раствора ПЭГ в культуральную среду и обратно 5—10 раз. В результате удается повысить частоту слияния клеток в 3—5 раз и резко уменьшить токсический эффект ПЭГ по сравнению с обычно применяемым способом (1 мин в 50 %-ном растворе ПЭГ). Жизнеспособность клеток, очевидно, увеличивается за счет снижения времени их контакта с 50 %-ным раствором ПЭГ.
ПЭГ производится многими иностранными фирмами («Merck», «Loba», «Sigma», «Koch-Light», «Baker», «Serva» и др.). По нашему опыту, наилучшим для слияния является ПЭГ фирмы «Loba» (Австрия) с молекулярной массой 1500 и 2000. Исследователь, начинающий работать с новыми, ранее не испытанными партиями ПЭГ, должен предварительно провести проверку на токсичность и на сливающую способность. ПЭГ с одной и той же молекулярной массой может варьировать по этим показателям.
Повышение pH раствора ПЭГ до 7.8—8.0 повышает частоту слияния клеток [12]. Для снижения токсичности в раствор в некоторых случаях добавляют 10 %-ный диметилсульфоксид и снижают при этом концентрацию ПЭГ до 35 % f[ 13]. Предложен еще один путь снижения токсичности ПЭГ — использование для слияния бескаль-циевой среды [14]. При слиянии клеток в суспензии перед обработкой ПЭГ проводят их агглютинацию. Для этой цели используют растительные лектины — ФГА [15] или поликатионы, например полиаргинин [16]. Наш опыт работы с ФГА показал, что использование этого лектина в данных условиях может приводить к резкому увеличению числа многоядерных клеток, которые характеризуются низкой жизнеспособностью.
В некоторых работах при слиянии клеток со сниженной адгезив-ностью возникает необходимость их перевода в монослой. Это относится к слиянию интерфазных клеток со слабо прикрепляющимися метафазными. Для изучения происходящей при таком слия-
нии преждевременной конденсации хромосом желательно, чтобы гибридные клетки вскоре после слияния прикреплялись к стеклу или к пластику [17]. Осаждение центрифугированием интерфазных и метафазных клеток на пластик, покрытый конканавалином А [17], заставляет клетки прикрепляться к субстрату, и их слияние в монослое с помощью ПЭГ становится возможным.
«Эпоха ПЭГ» в гибридизации клеток началась с середины 70-х годов и продолжается до сих пор. Однако в последние годы начинает распространяться метод слияния клеток с помощью электрошока (подробно см. [18]). Здесь мы остановимся лишь на основах метода и на новинках, появившихся в нем в последние годы.
Метод электрослияния основан на электропробое мембран двух контактирующих клеток в месте их контакта. Для этого контактирующие клетки подвергаются действию электрических импульсов высокого напряжения (0.5—6 кВ/см) продолжительностью 1 — 50 мкс [18]. Предварительное сближение клеток может быть достигнуто многими способами: 1) механически, с помощью микроигл;
2) путем совместной посадки клеток-партнеров в виде плотного смешанного монослоя; 3) соосаждением в центрифужной пробирке;
