Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
51. Kaneda Y., Yosluda М. C., Kohno К¦ et al. Chromosomal assignment of the gene for human elongation factor 2 /j Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1984. Vol. 81. P. 3158— 3162.
52. Creagan R. P., Chen S., Ruddle F. H. Genetic analysis of the cell surface: association of human chromosome 5 with sensitivity to diphtheria toxin in mouse-hu-man somatic cell hybrids // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. Vol. 72. P. 2237— 2239. ‘*
53. Kohno K-, Uchida Т., Mekada E., Okada J. Characterization of Diptheria-Toxin-
resistant mutants lacking receptor function or containing nonribosylatable elongation factor 2 // Somat. Cell Mol. Genet. 1985. Vol. 11. P. 421—431.
54. Gupta R. S. Podophyllotoxin resistance: a codominant selection system for quantita-
tive mutagenesis studies in mammalian cells // Mutat. Res. 1981. Vol. 83. P. 261—270.
55. Копншн.Б. П., Ставровская. А. А. Генетический анализ резистентности соматических клеток мыши к колхицину // Генетика. 1978. Т. 14. С. 1625—1633.
56. Горностаев В. С., Игнатова Т. Н. Различная степень стабильности устойчивых к колхицину клонов мышиной гепатомы XXII // Цитология. 1984. Т. 26. С. 594—598.
57. Hidaka К-, Akiyama S. J., Kuwano M. Amphotericin В resistance is recessive
in Chinese hamster hybrid cells//J. Cell. Physiol. 1981. Vol. 106. P. 41—47.
58. Lankas G. R. Effect of cell growth rate and dose fraction on chemically induced ouabain-resistant mutations in Chinese hamster V-79 cell//Mutat. Res. 1979. Vol. 60. P. 189—196.
Методы получения и культивирования протопластов
'И. И. Смоленская, А. В. Носов
•Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева АН СССР, Москва
Развитие метода культивирования клеток растений открыло широкие возможности для изучения биологии клетки, ее биосинтети-
ческого потенциала, а также генетических основ стабильности и изменчивости клеток. В ряде случаев для этого необходимо уметь культивировать одиночные клетки. Одним из методов их получения является изолирование протопластов. В определенных условиях клетки, лишенные клеточной стенки, регенерируют ее заново и, возвращенные к нормальным условиям существования, начинают проявлять все характерные свойства культивируемых клеток, такие как деление и тотипотентность. Изолированные протопласты более доступны для введения в них экзогенных факторов, что позволяет также изучать влияние биологически активных соединений на жизнедеятельность клеток растений.
В настоящее время исследователи рассматривают протопласты как модель, с помощью которой можно изучать целый ряд проблем как на клеточном, так и на молекулярном уровне, имеющих большое значение при решении практических задач биотехнологии и сельского хозяйства.
Методы выделения протопластов были успешно разработаны в целом ряде лабораторий.
Существуют два метода выделения протопластов. Один состоит в механическом удалении клеточной стенки в среде, содержащей осмотический стабилизатор. В этом случае получается незначительное число протопластов, и в основном источником их служат вакуоли-зированные клетки паренхимного типа. Этот метод сейчас используется редко. Другой метод связан с энзиматическим удалением клеточной стенки. При правильно подобранных условиях изолирования и культивирования можно получить большое число протопластов, которые длительное время сохраняют жизнеспособность. Именно этот метод является общепринятым в настоящее время [2].
Материал для выделения протопластов
Сущность метода изолирования протопласта состоит в удалении клеточной стенки таким образом, чтобы в нем не возникало необратимых изменений. Для этого наружное и внутреннее осмотическое давление на мембрану должно быть таким, чтобы клетки не разрушались и не наблюдалось лизиса протопластов. В настоящее время протопласты получают из однодольных и двудольных растений. Используют листья, проростки, клубни, лепестки, плоды, клубеньки бобовых растений, опухолевые клетки различного происхождения, ткани и клетки, культивируемые in vitro. Протопласты могут быть получены из микроспор, взятых на стадии тетрад, или одноклеточной пыльцы.
Для выделения протопластов обычно используют молодое растение, еще не начавшее цветение. Имеют значение также и условия его выращивания: интенсивность освещения, фотопериод, влажность и температура. Большое число протопластов удается получить из растений, выращенных в стерильных условиях.
Протопласты выделяют и из культуры тканей. Преимуществом является то, что ткань растет в стерильных условиях и не требует
специальной асептической обработки. Подбор сред для культивирования облегчается, поскольку за основу может быть взята среда, на которой выращивалась ткань. Успешное получение протопластов в этом случае также зависит от ряда факторов. Во-первых, от возраста исходной ткани в цикле выращивания: по данным многих авторов, лучше брать ткань, находящуюся на стадии раннего экспоненциального роста, когда в популяции имеется значительное число клеток, способных начать деление. Во-вторых, от особенностей роста ткани: каллусная ткань многих видов растений образует на агаризо-ванной среде плотную массу, состоящую как из меристемоидных клеток, находящихся в фазе растяжения, так и из клеток паренхимного типа и трахеидных элементов. Все это осложняет работу, требует специальных методов очистки при выделении протопластов и дает небольшой их выход по сравнению с количеством взятой ткани.
