Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Наиболее пригодна для выделения протопластов рыхлая, не дифференцированная ткань, образующая небольшие агрегаты клеток при переводе в жидкую среду. При добавлении ферментов агрегаты легко распадаются на отдельные клетки. Чаще для выделения протопластов применяют суспензионные культуры клеток. Обычно они имеют небольшое число клеток с уплотненными стенками, не разрушающимися при действии целлюлитических ферментов, и их легко удалить фильтрованием. Кроме того, суспензии удобны для разных манипуляций: фракционирования клеток, введения изотопов, получения синхронных популяций. t
Выделение протопластов
В общем виде способ получения протопластов представлен на рисунке. Однако для каждой системы тканей этот способ требует корректировки. В некоторых случаях бывает необходима предварительная подготовка материала. Так, чтобы получить жизнеспособные протопласты из листьев гаплоидного растения табака, ткань выдерживают в темноте в течение нескольких часов в растворе 0.4 М сахарозы, а побеги и листья бобов помещают на 1 ч в смесь 0.5 М сорбита и 5 • 10_3 М СаСЬ, чтобы вызвать предварительный плазмолиз и сократить время инкубации в ферменте. Иногда перед выделением протопластов растение на некоторое время помещают в темноту либо на короткое время на яркий свет.
Все работы по изолированию протопластов проводятся в стерильных условиях. Ткани, взятые от целого растения, выращенного в поле или теплице, тщательно стерилизуют растворами 70 %-ного спирта, 0.1 %-ного диацида или 2—5 %-ного гипохлорита. Затем их несколько раз промывают стерильной водой. С листьев, там где это возможно, снимают эпидермис стерильными инструментами,и небольшие кусочки ткани помещают в раствор фермента.
Культура клеток не требует дополнительной стерилизации. Для выделения протопластов используют 2- и 3-суточные суспензии клеток. Однако оптимальный для получения протопластов возраст
Лист
Культура клеток
•Г '‘&Г
Стерилизация
ссагяптпгтъг,
fn
Выделение протопластов
7-ТГ
;гг
Щ.
I /
< Li
Отмывание
фермента
колонии
Фильтрация через нейлоновый фильтр (поры 60 мкм)
Протопласты
деление
Добавление среды
о о о о о о о
j1
Инкубирование
Регенерация клеточной стенки
Схема, иллюстрирующая этапы получения и культивировании протопластов из клеток растений.
ткани зависит от конкретных особенностей цикла ее роста. Определение параметров роста суспензии клеток в цикле выращивания, ее морфологические характеристики, а также специальная подготовка являются необходимыми этапами в работе. Несомненно, существуют различия в строении клеточных стенок тканей разного происхождения. Изменяя условия культивирования ткани, из которой собираются выделять протопласты, можно добиться большей гомогенности популяции по этому признаку. Это достигается изменением соотношения гормональных факторов, состава макро- и микросолей, содержания СаС12, аминокислот и сахаров.
В некоторых случаях каллусные и суспензионные культуры пред-инкубируют в растворе плазмолитиков. Подбор конкретных соединений и их концентраций для выделения протопластов также зависит от вида ткани и условий, в которых она растет. Одним из методов установления концентраций этих агентов служит прямое наблюдение за клетками под микроскопом при инкубации их в растворах с повышающимся уровнем осмотического потенциала. При этом плазмолиз может быть полным, когда клеточная оболочка целиком отошла от протопласта и под микроскопом видно, что округленная клетка лежит в центре полости, ограниченной оболочкой. Возможен частичный плазмолиз, когда клеточная стенка отошла от протопласта с одной стороны, но на значительном ее протяжении, и пристеночный плазмолиз, при котором наблюдается отхождение клеточной оболочки от протопласта лишь в некоторых местах.
В качестве осмотически активных веществ обычно используют различны^ сахара:, глюкозу, сахарозу, маннит и сорбит. Маннит применяют чаще, чем сорбит, так как он обладает слабой проникающей способностью в клетки, проникновение в клетки сорбита сопровождается и проникновением ферментов. Применяется также смесь сорбита и маннита. Использование в ферментных системах растворов глюкозы и сахарозы создает условия, близкие к условиям культивирования клеток, хотя эти сахара активно проникают через мембрану. Для некоторых видов тканей применение сахаров не дает хороших результатов. В этом случае используют в качестве осмотических стабилизаторов солевые растворы, хотя известно, что соли обладают большей проникающей способностью, чем сахара, и снижают активность некоторых гидролитических ферментов. Растворы макро- и микросолей часто берут за основу, к которой добавляют другие осмотически активные вещества. Это смягчает процесс выделения протопластов, особенно если он длителен, и приближает его к условиям культивирования ткани в суспензии. Неправильный выбор осмотического агента может привести к разрыву плазмалеммы либо вызвать спонтанное слияние протопластов и образование многоядерных клеток; оптимальными для выделения протопластов являются 0.3 до 0.7 М растворы.
