Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Протопласты из суспензионной культуры клеток сахарной свеклы.
1) В 250 мл круглодонные колбы помещают 10 мл 3-недельной суспензии клеток и ставят на качалку со скоростью 60 качаний в мин и амплитудой 7—8 см при температуре 28 °С; 2) через 48 ч в колбу с суспензией добавляют 10 мл раствора фермента (макро- и микросоли по Шенку и Хильдебрандту (табл. 1) +0.56 М сорбит, 0.4 %-ная целлюлаза Onozuka R-10, 0.2 %-ный целлюлизин, 0.2 %-ный маце-розим, 0.8 %-ная дрейселаза, pH 5.5—5.7); фермент этого состава смешивают с суспензией в отношении 1:1; 3) колбы стерильно закрывают фольгой и ставят на качалку (условия те же, что описаны выше) на 18—20 ч в темноту при 22—23 °С; 4) дальнейшие операции с суспензией протопластов проводят так же, как и с листьями табака
\
(раствор для отмывания фермента: макро- и микросоли по Шенку и Хильдебрандту + 0.36 М сорбит, pH 5.5—5.7); 5) число протопластов подсчитывают, определяют процент живых и рассеивают в чашки Петри (60 мм) при плотности высева 5 • 104—105 клеток на 1 мл; 6) протопласты помещают во влажную камеру при температуре 25 °С в темноту.
Цитологическое наблюдение
Протопласты табака (см. рисунок), помещенные на среду Мура-сиге и Скуга, через 24 ч образуют клеточную стенку и через
2—3 сут наблюдается в них первое деление. Второе деление происходит на 7—8-е сутки, затем образуются 8-клеточные колонии, и к 21 — 30-м суткам культивирования формируются многоклеточные колонии.
При перенесении их на агаризованную среду образуется каллус, из которого при определенных условиях культивирования и состава среды может быть получено целое растение.
Протопласты, изолированные из суспензионной культуры сахарной свеклы, в течение 1-х суток культивирования формируют клеточную стенку на среде Щенка и Хильдебрандта или Као и Михайлюка. Первое деление происходит на 2—3-и сутки. В течение 7—10 сут образуются колонии из 4—8 клеток. Через 2 нед при перенесении образовавшихся клеток на среду Шенка и Хильдебрандта, содержащую 3 % сахарозы, колонии увеличиваются в размерах. Из них можно возобновить суспензию через 30—40 сут после получения протопластов.
Литература
1. Глеба Ю. Ю., Сытник К¦ М. Слияние протопластов и генетическое конструирование
высших растений. Киев, 1982. 102 с. ,
2. Cocking Е. С. Fusion and somatic hybridization of higher plant protoplasts // Microbial and plant protoplasts. London, 1976. P. 189.
3. Butenko R. G. Cultivation of isolated protoplasts and hybridization of somatic plant cells // Intern. Rev. Cytol. 1979. Vol. 59. P. 323.
4. Dudits D. The effect of selective conditions on the products of plant protoplasts fusion // Cell genetics in higher plants. Budapest, 1976. P. 153.
5. Eriksson Т., Glimelius K-, Wallin A. Protoplast isolation, cultivation and development//Frontiers of plant tissue culture. Calgary (Canada), 1978. P. 131.
6. Gamborg O. L., Shyluk J. P., Shanin E. A. Nutrition, media and characteristics of plant cell and tissue cultures//Plant tissue culture: Methods and application in agriculture / Ed. T. A. Thorpe. London, 1981. P. 115.
7. Kao R. N., Michayluk M. R. A method for high-frequency intergenetic fusion of plant protoplasts//Planta. 1974. Vol. 115. P. 355.
8. Gamborg O. L., Eveleigh D. E. Culture methods and detection of glucanases in cultures of wheat and barley // Canad. J. Biochem. 1968. Vol. 46, N 5. P. 417.
9. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15, N 3. P. 473.
10. Nagata Т., Takebe /. A. Cell wall regeneration and division in isolated tobacco mesophyl protoplasts//Planta. 1970. Vol. 92, N 3. P. 301.
11. Schenk R. U., Hildebrandt A. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures // Canad. J. Bot. 1972. Vol. 50, N I. P. 199.
Гибридизация клеток животных
И. А. Прудовский, С. И. Сухарев
Институт молекулярной биологии АН СССР,
Институт электрохимии им. Фрумкина АН СССР, Москва
Гибридизация клеток — экспериментальный подход, нашедший широкое применение в биологии за последние 20 лет. Создание клеточных гибридов дает исследователю возможность обнаруживать существование внутриклеточной регуляции различных процессов. Сливая клетки, различающиеся по каким-то временным характеристикам (например, по фазе цикла) или по постоянным признакам (по способности или неспособности образовывать опухоли, наличию или отсутствию черт специфической диффереицировки), в гибридах нередко удается наблюдать исчезновение характеристик одной из клеток и «навязывание» ей свойств ее партнера по гибридизации. Так, были обнаружены реактивация синтеза ДНК при слиянии непролиферирующих клеток с пролиферирующими [1], преждевременная конденсация хромосом при слиянии интерфазных клеток с митотическими [2], исчезновение злокачественного фенотипа при слиянии опухолевых клеток с нормальными [3].
Гибридизация создает возможность картирования хромосом [4], что достигается благодаря избирательной потере клеточными гибридами хромосом одного из партнеров. Сопоставление фенотипических признаков клеточных гибридов с утерей хромосом того партнера, чей хромосомный набор подвергается постепенной элиминации, позволяет,выяснить, в какой хромосоме расположен ген, определяющий интересующий нас признак. По-видимому, картирование хромосом удастся сильно упростить, используя /для слияния в качестве одного из партнеров не целые клетки, а искусственно созданные микроклетки, несущие отдельные хромосомы [5].
