Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Вахтин Ю.Б. -> "Методы культивирования клеток" -> 84

Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.

Вахтин Ю.Б., Соминина А.А. Методы культивирования клеток — Л.: Наука, 1988. — 313 c.
Скачать (прямая ссылка): metodikultivirovaniya1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 78 79 80 81 82 83 < 84 > 85 86 87 88 89 90 .. 171 >> Следующая

То же
V79 Амфотерицин В Ингибирование метаболизма
СНО, L HeLa, V79, дип Уабаин холестерина
лоидные фибробласты Ингибирование активности
человека Ка + /К+-АТФазы
Примечание.* — указаны номера хромосом человека.
мишени в клетке. В этом случае устойчивость к антиметаболитам обусловлена изменением дроницаемости плазматической мембраны устойчивых клеток сразу к целому ряду токсичных агентов. В устойчивых клетках недавно обнаружены амплификации генов, кодирующих мембранный гликопротеин с молекулярной массой 170 000 и цитозольный белок с молекулярной массой 21 ООО, которые, по-види-мому, обеспечивают повышенный синтез этих белков в устойчивых клетках [37—39].
В таблице представлены примеры вариантов клеточных линий, устойчивых к ядам, и некоторые их характеристики. Эти характеристики включают используемый селективный агент, механизмы токсичности селективных агентов, биохимическую основу устойчивости, тип наследования признака устойчивости в гибридных клетках и локализацию на хромосомах человека, если она известна.
Примеры селекции клеток
Селекция клеток L929 на устойчивость к 8-азагуанину (культура клеток не должна быть заражена микоплазмой): 1) определить эффективность клонирования исходной популяции (см. рисунок); по 300 клеток посеять в 50 мм чашки Петри (среда Игла+10 %-ная сыворотка крупного рогатого скота), чашки поместить в СОг-инку-батор; 2) посеять по 3 • 105 клеток во флаконы Карреля (5—7 флаконов) или по 106 клеток в 100 мм чашки Петри — 3 чашки (3—4 флакона или 2 чашки — контроль); 3) через 36—40 ч клетки промыть раствором Хэнкса, добавить свежей среды без сыворотки, во флаконы Карреля по 4 мл и в чашки Петри до 8 мл; во флаконы добавить до 10 мкл МННГ (1 мг МННГ растворить в 1 мл ДМСО)
f
Биохимические изменения Генетические харак Влияние изменений Литературный
в устойчивых клетках теристики признака на жизнедеятель источник
ность клеток
Изменение связывания поверх Рецессивный, Влияет [30, 52, 53]
ностного рецептора с токси хромосома 5
ном
Изменение тубулинов --- --- [54]
Изменение проницаемости Неполный доми Влияет [2, 37, 38,
мембраны к яду. Амплифика нантный 55, 56]
ция генов, кодирующих белки
с молекулярной массой
170000---180000 и 19000---
21000
Снижение количества холесте Рецессивный » [57]
рина в мембранах
Специфические изменения Неполный доми » [33---35, 58]
Ыа + /К+-АТФазы нантный
в чашки Петри по 20 мкл, можно сделать промежуточное разведение мутагена средой без сыворотки; конечная концентрация мута-1 гена 2.5 мкг/мл; 4) через 2 ч после инкубации клеток с мутагеном при 37 °С среду удалить, промыть клетки раствором Хэнкса 2 раза, добавить полную среду и поместить клетки в термостат на 2—3 ч; 5) среду удалить, клетки снять смесью трипсина с версеном (1 : 1), сосчитать, часть клеток посеять для определения эффективности клонирования (300 клеток на 50 мм чашку Петри), большую часть клеток посеять во флаконы Карреля или чашки Петри; 6) на 3-и сутки клетки пересеять (чашку и флакон 1:3); 7) на 6-е сутки клетки сосчитать и посеять в 100 мм чашки Петри, 10 чашек по 2.5 • 105 клеток (контроль — столько же чашек посеять с немутагенизирован-ными клетками); после прикрепления клеток добавить 150 мкл
8-азагуанина (3000 мкг/мл) до конечной концентрации 30 мкг/мл;
8) посеять клетки на клонирование в 50 мм чашки Петри, 3—4 чашки по 300 клеток; 9) среду с 8-азагуанином менять 2 раза в неделю; 10) через 15 сут выделить выросшие клоны с помощью стальных колец, клетки поместить в пенициллиновые флаконы, маленькие флаконы Карреля, чашки Петри диаметром 30 мм; 11) размножить и заморозить. Часть клеток оставить для проверки: 1) способности [роста на среде ГАТ (см. приготовление растворов), 2) стабильности сохранения признака в отсутствие селективного агента, 3) активности фермента ГГФРТ в устойчивых клетках.
Определение активности ГГФРТ в отобранных на устойчивость к 8-азагуанину вариантах:
Предыдущая << 1 .. 78 79 80 81 82 83 < 84 > 85 86 87 88 89 90 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed