Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
5) эмбрионы ставят на инкубацию (на 3 сут при 39 °С), при этом идет размножение вируса и его накопление в аллантоисной жидкости;
6) на ночь эмбрионы помещают в холодильник, это необходимо для того, чтобы сосуды эмбрионов спались и при получении аллантоисной жидкости она не оказалась засоренной эритроцитами; 7) прожигают яйца спиртовым факелом и ножницами срезают с тупых концов скорлупу; 8) отсасывают аллантоисную жидкость пастеровской пипеткой или шприцем емкостью 5—10 мл с широкой иглой; жидкость не должна содержать кровь и желток, она должна быть опалесцирующей, что свидетельствует о накоплении в ней вируса; образцы t аллантоисной жидкости с максимальной опалесценцией отбирают‘в отдельные емкости (с эмбриона обычно получают 5— 10 мл аллантоисной жидкости); 9) центрифугируют аллантоисную жидкость 20 мин при 3000 g («осветление») , это необходимо для очистки жидкости от клеток и клеточного детрита; аллантоисную жидкость можно непосредственно использовать для слияния, если титр вируса в ней не менее 1000, хранить ее следует в замороженном виде небольшими порциями, каждая для одного слияния.
1.2. Титрование и концентрирование вируса Сендай: 1) срезают скорлупу с тупого конца яйца, содержащего 9—13-суточный куриный эмбрион; 2) перерезают ножницами крупные кровеносные сосуды, питающие эмбрион, собирают пастеровской пипеткой или шприцем аллантоисную жидкость с вытекшей в нее кровью; 3) разбавляют аллантоисную жидкость раствором Хэнкса в 5—10 раз и центрифугируют 5 мин при 700 g; 4) сливают супернатант, ресуспензируют осадок эритроцитов в 10 мл раствора Хэнкса без индикатора фенолового красного; 5) вносят автоматической пипеткой в круглодонные ячейки 96-ячеечной пластиковой платы для титрования (Ленинградский завод медицинских полимеров) суспензию эритроцитов; в первые ячейки каждого ряда вносят по 90 мкл суспензии, в остальные — по 50 мкл (имеются в виду длинные ряды, по 12 ячеек в каждом);
6) добавляют в первые ячейки рядов по 10 мкл тестируемых образцов вируса, в два ряда добавляют раствор Хэнкса (контроль); ресуспензируют эритроциты, переносят в следующую ячейку ряда 50 мкл
суспензии, пипетируют; затем 50 мкл переносят из второй ячейки в третью и так далее до конца каждого ряда, один образец аллантоисной жидкости следует тестировать в двух рядах; 7) после того как плата простояла 45—60 мин при комнатной температуре в контрольных рядах, куда вирус не был внесен, осадок эритроцитов имеет вид ровной круглой бляшки. Там, где был внесен вирус и произошла гемагглютинация, осадок имеет «размытый» вид. Максимальное разведение, при котором все еще происходит гемагглютинация, соответствует титру вируса в тестируемом образце.
В том случае, если титр вируса в аллантоисной жидкости менее 1000, вирус следует сконцентрировать. Аллантоисную жидкость центрифугируют 30 мин при 50 000 g. Супернатант сливают. Осадок вирусных частиц ресуспензируют в малом объеме растворы Хэнкса. Объем подбирают так, чтобы титр концентрированного вируса был 5000—10 000. Концентрированный вирус разделяют на небольшие порции, достаточные для одного слияния, и замораживают.
1.3. Слияние клеток вирусом Сеидай в моиослое: 1) Клетки А (обычно это те партнеры по слиянию, которые лучше прикрепляются» к стеклу и распластываются на нем) высевают в концентрации 100 тыс. клеток / мл в 2 мл культуральной среды, содержащей 10 % сыворотки, в пенициллиновые флаконы с покровными стеклами, инкубация при 37 °С продолжается 2—4 ч; 2) инактивация вируса Сендай: 1—2 мл жидкости, содержащей вирус, наносят на чашку Петри диаметром 90 мм, покачивая чашку, дают жидкости разлиться по всей ее поверхности, выставляют чашки на 5 мин на расстоянии 15 см от включенной ультрафиолетовой лампы БУВ-30-2, при этом происходит инактивация вируса — он теряет способность к размножению, но сохраняет способность сливать клетки; жидкость, содержащую инактивированный вирус, собирают с чашек Петри пипеткой; 3) из флаконов, содержащих покровные стекла, на которых растут клетки А, сливают культуральную среду и промывают стекла холодным раствором Хэнкса; 4) на покровные стекла наносят по 0.3 мл охлажденной жидкости, содержащей инактивированный вирус; затем флаконы выдерживают 10 мин при 4 °С для сорбции вирусных частиц на поверхности клеток А; 5) вносят во флаконы по 0.2 мл холодного раствора Хэвкса, содержащего клетки Б, количество клеток Б нужно подбирать опытным путем; чем хуже клетки Б прикрепляются и чем меньше их размеры, тем больше следует их брать; в случае, если клетки Б — фибробласты или клетки фибробластоидной линии, достаточно вносить во флаконы 300— 400 тыс. клеток, если это лимфоциты, то их количество должно составлять от 500 тыс. до 2 млн., для куриных эритроцитов или кариопластов (ядерные фрагменты клеток, получаемые при энуклеации) — 2—10 млн.; после внесения клеток Б во флаконы их выдерживают 20 мин при 4 °С, в это время происходит агглютинация клеток А и Б; 6) флаконы переносят в водяную баню при 37 °С и инкубируют 45 мин (слияние заметно усиливается при резком повышении температуры) ; 7) флаконы промывают теплым раствором Хэнкса. Затем
