Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
4) путем агглютинации клеток лектинами, поликатионами или растворами ПЭГ в низкой концентрации; 5) с помощью диэлектрофореза (клетки образуют цепочки).
Первоначально особенно популярным был последний метод приведения клеток в контакт. Однако в последнее время многие исследователи отказались от него, так как большинство клеток, образующихся в результате слияния «диэлектрофорезных цепочек», оказывается многоядерными.
Клетки суспензионных культур предпочитают приводить в контакт, осаждая их центрифугированием. Хорошо прикрепляющиеся к твердому субстрату клетки достаточно легко сливать в монослое. Существуют два способа. В первом случае силовые линии электрического поля направлены параллельно поверхности пластиковой или стеклянной подложки с клетками, во втором случае силовые линии проходят через специальную электропроводящую подложку, на которой растут клетки. Жизнеспособность клеток, слитых методом электрошока, повышается, если их затем в течение 30—60 мин инкубировать в бескальциевой среде. Само слияние (пробой) также должно проводиться в среде, не содержащей ионов кальция. Показано, что кратковременный гипотонический шок после электропробоя заметно ускоряет слияние клеток.
Имеются сведения о том, что предобработка клеток протеолити-ческими ферментами — диспазой, проназой, трипсином [19] —заметно улучшает эффективность электрослияния. Аналогичные сведения получены и при слиянии клеток при помощи ПЭГ. Наибольшая эффективность слияния монослойных клеток отмечается через несколько часов после обработки их трипсином для пересева [14]. По-видимому, протеазы снимают какие-то поверхностные белки, препятствующие слиянию клеток. Однако нами было обнаружено, что
обработка клеток протеазами не всегда хорошо влияет на слияние с помощью электрошока.
Методом электрошока удается слить разные клетки. В последнее время этот метод был успешно применен для слияния клеток эмбрионов ранних стадий развития [20], а также для получения гибридом [21, 22]. Заметным преимуществом метода электрослияния перед методами с использованием вируса Сендай и ПЭГ является возможность четкого разделения стадий агглютинации клеток и собственно их слияния. Этим преимуществом воспользовались для создания очень изящного способа получения гибридом [21]. На первом этапе специфический антиген, связанный с биотином, инкубируют с суспензией лимфоцитов, полученных из селезенки мыши, иммунизированной данным антигеном. Одновременно осуществляют прижизненную химическую пришивку авидина к клеткам миеломы. На втором этапе проводят совместную инкубацию лимфоцитов и клеток миеломы. За счет специфического взаимодействия биотин—авидин происходит агглютинация клеток миеломы и иммунокомпетентных лимфоцитов, несущих на поверхности антитела к специфическому антигену. На третьем этапе клетки подвергаются электрошоку. Гибриды клеток отбирают на среде ГАТ. Практически все клоны гибридных клеток продуцируют антитела против нужного антигена, что упрощает задачу идентификации и отбора клонов-продуцентов специфических моноклональных антител.
Эффективность существующих в настоящее время методов слияния клеток достаточно высока. Так, с помощью электрошока удается слить до 80 % клеток в препарате. Однако необходимо иметь в виду разрешение двух задач при электрослиянии: преимущественное получение двуядерных гибридов и снижение гибели клеток при слиянии. Ниже приведены некоторые методы слияния клеток, рекомендуемые нами читателям. Мы сочли нужным поместить среди них методы слияния клеток с помощью вируса Сендай, несмотря на их трудоемкость, связанную с необходимостью наращивания и титрования вируса (соответствующие методики также приведены) — пока эти методы отличаются наибольшей мягкостью, что делает их особенно ценными в цитологических исследованиях, где важно сохранение высокой жизнеспособности и хорошей морфологии клеток. Приведенные нами методы слияния клеток с помощью ПЭГ не включают использования ДМСО, бескальциевой среды и агглютинирующих лектинов. Мы полагаем, что эти усовершенствования в ряде случаев могут быть полезны, но их следует применять лишь при необходимости, так как приходится подбирать условия к каждому конкретному типу клеток. Приведенные методы электрического слияния различаются способом сближения клеток: с помощью диэлектрофореза, центрифугирования, совместной посадки клеток на подложку.
В заключение следует указать, что для цитологических работ, когда предполагается исследование гетерокарионов, оптимальным является слияние клеток в монослое. В остальных случаях, когда необходимо получить клоны гибридных клеток, лучше использовать
методы слияния клеток в суспензии, позволяющие сливать очень большие количества клеток-партнеров (десятки и сотни миллионов).
1.1. Получение вируса Сендай. Небольшие количества вируса Сендай для последующего размножения можно получить в Институте вирусологии АМН СССР, Москва (обычно титр вируса в предоставляемых образцах составляет 2500—5000); 1) приготавливают 10 мл 1000-кратного разведения вируса на растворе Хэнкса с пенициллином и стрептомицином (по 1000 ед/мл); 2) яйца с 9-суточными куриными эмбрионами обжигают с тупого конца «спиртовым факелом» (намотанная на стеклянную палочку горящая вата, пропитанная спиртом); 3) стерильным шильцем проверчивают маленькие отверстия (диаметром 1 мм) в тупых концах яиц, следят, чтобы при этом не образовывались трещины в скорлупе; 4) вводят в каждый эмбрион с помощью шприца по 0.2 мл раствора Хэнкса с вирусом, заливают отверстия в скорлупе каплей расплавленного парафина;
