Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
2,4-Д 2 - 1
Сахароза Сахара 10 000 30 000
20 000 30 000
Маниит - 0.7 М
i Величина pH 5.8 5.6
'' ' 5.5 I 5.5
Условия, в которых культивируют протопласты, в основном соответствуют тем, которые применяются для выращивания в культуре клеток растений. Состав минеральных солей может быть несколько
Вещество мг/л Вещество мг/л
Макросоли Микросоли
NH4NO3 600 Н3ВО3 3.00
KNO3 1900 KJ 0.75
MgS04- 7Н20 300 MnS04- н2о 10.00
КС1 300 Na2Mo04- 2Н20 0.25
FeSO„- 7Н20 28.75 CuS04- 5Н20 0.025
Na2-EDTA 37.3 СоСЬ- 6Н20 0.025
Сахара Витамины
Глюкоза 68 400 Никотинамид 1
Сахароза 125 Аскорбиновая кислота 1
Фруктоза 125 Пиридоксин- НС1 1
Ксилоза 125 Витамин А 0.005
Манноза 125 Тиамин- НС1 10
Рамноза 125 Витамин Дз 0.005
Целлобиоза 125 Са-пантотеиат 0.5
Сорбит 125 Фолиевая кислота 0.2
Маннит 125 р-Аминобензойная кислота 001
Рибоза 125 Биотин 0.005
Холинхлорид 0.5
Ооганически« кислоты Рибофлавин 0.1
Пируват 5 Инозит 100
Лимонная кислота 10 Витамин Bi2 0.01
Яблочная » 10 Гормоны
Фумаровая » 10 2,4-Д 0.2
Гидролизат казеина 125 Зеатин 0.5
Кокосовое молоко 10 НУК 1
изменен. Как правило, среда должна состоять из осмотического стабилизатора, неорганических соединений, источников углерода, витаминов, источников органического азота и фитогормонов. Маннит, сорбит и их комбинации могут быть использованы в качестве осмотических стабилизаторов. За основу берется состав минеральных солей в средах для культивирования клеток растений. Можно менять соотношение аммонийного и нитратного азота в зависимости от потребности в них клеток, увеличивать концентрацию СаСЬ для стабилизации образующейся клеточной стенки. После того как образовались и начали делиться клетки, они могут быть помещены в условия культивирования, применяемые обычно для клеток растений.
В качестве источников углерода используют глюкозу, сахарозу, их смеси. Сахароза не всегда может быть подходящим компонентом среды для протопластов. В некоторых случаях добавляют рибозу, ксилозу, фруктозу, маннозу и другие сахара.
В состав витаминов при культивировании протопластов должны входить тиамин, пиридоксин и никотиновая кислота. При небольшой плотности высева требуется добавление и других витаминов.
В качестве источников органического азота добавляют одну или больше аминокислот. Обычно используют гидролизат казеина, представляющий собой смесь аминокислот, и добавляют его в том случае, если в среде недостаточное содержание неорганического азота, а его концентрацию уже нельзя увеличить.
Ауксины и цитокинины требуются для клеточного деления и дальнейшего развития растительных клеток; обычно используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную (2,4-Д) и нафтилуксусную (НУК) кислоты (ауксины), кинетин, бензиладенин, зеатин (цитокинины) и др. Оптимальные концентрации варьируют, и их подбирают в каждом отдельном случае.
Большое значение при культивировании протопластов имеют и другие условия. Так, pH среды должен составлять от 5.4 до 5.8, температура — от 22 до 28 °С. Иногда требуется слабое освещение, не более 2000 лк. Жизнеспособность протопластов зависит от начальной плотности высева, обычно их культивируют при плотности высева от 104 до 106 на 1 мл среды. Иногда для повышения числа делящихся протопластов в среду добавляют различное количество кондиционированной среды, на которой некоторое время росли клетки, или же используют так. называемый кормящий слой, состоящий из облученных клеток, — такие клетки не делятся, но остаются метаболически активными, т. е. продукты жизнедеятельности инактивированных клеток восполняют необходимые компоненты среды. Обычно эти методы применяют в том случае, если протопласты высевают с небольшой плотностью.
Единичные протопласты можно культивировать в небольших количествах среды в пластмассовых или стеклянных чашках Купрака либо в микрокамерах. Это бывает необходимо для получения колонии нз одной клетки и наблюдения за ее развитием. В дальнейшем при перенесении таких колоний на агаризованную среду определенного состава можно получить каллус, а затем и целое растение.
