Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Белок. Для определения содержания белка чаще всего используют флюоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), тетраметилродаминизо-тиоцианат (ТРИТЦ) и флюорескамин (ФК). Флюорескамин в отличие от других красителей очень быстро реагирует с аминогруппами белков, имеет малое время жизни в водном растворе, не связанный краситель не флюоресцирует. Он удобен для определения белков клеточной поверхности нефиксированных клеток.
Как правило, интенсивность флюоресценции красителей на белок поверхности клеток пропорциональна площади поверхности клетки, а для других белковых красителей — объему клетки [8—10].
Ферменты. Активность ферментов в клетках исследуется с по-
мощью флюорогенных субстратов, превращающихся при ферментативном расщеплении в флюоресцирующий продукт. Трудности анализа связаны с ограничением скорости поступления субстрата в живую клетку и диффузией продукта реакции в течение анализа из клетки. Несколько флюорогенных субстратов, использующихся в аналитической биохимии, адаптированы для ПЦМ и позволяют проводить анализ кислой и щелочной фосфатаз [11, 12], эстераз [13], дегидрогеназ [13], глюкоронидаз [12], аминопептидаз [11] и др. Наибольшее употребление получил флюоресцеиндиацетат (ФДА) и его аналог, характеризующийся замедленной диффузией из живой клетки, — карбоксифлюоресцеиндиацетат (с-ФДА) [13,
14]. Одной из задач, решаемых с помощью ФДА и с-ФДА, является выявление и определение доли в исследуемой популяции поврежденных и мертвых клеток (пропись № 3).
Антигены поверхности клетки. Иммунофлюоресцентный анализ клеточной поверхности — расширяющаяся область применения ПЦМ. Обычно используется метод непрямой иммунофлюоресценции как более чувствительный, исследования проводят на цитометрах, имеющих лазерное возбуждение. Окрашивают, как правило, живые клетки, которые затем могут быть фиксированы этанолом или параформальдегидом. Анализ получающихся гистограмм распределения клеток по интенсивности флюоресценции требует тщательности и опыта работы, так как субпопуляции положительных и отрицательных по исследуемому антигену клеток имеют широкие, чаще всего заметно перекрывающиеся гистограммы, форма которых в общем случае заранее не известна. Должен быть определен также уровень неспецифического окрашивания с помощью антисыворотки на отсутствующие в исследовании антигены [15, 16] .
Другие клеточные компоненты и характеристики. Из многочисленных возможностей анализа с помощью ПЦМ следует отметить также исследования клеточных рецепторов, их поверхностной плотности и перераспределения [17, 18], микровязкости клеточной мембраны и цитоплазмы [19, 20], потенциала, клеточной мембраны [21, 22], внутриклеточного pH [23, 24], липидов [25], изменений структуры хроматина [26, 27], а также исследования нескольких параметров одновременно [4, 5, 9, 10, 15, 28, 29].
И
Исследование кинетики клеточного цикла
Одно из наиболее эффективных применений ПЦМ получила в исследованиях по клеточной кинетике. Различают статический и динамический ПЦМ-анализ параметров клеточного цикла. Основой статического метода является ДНК-гистограмма (рис. 2), форма которой определяется соотношением клеток в фазах G:, S и G2+M клеточного цикла. Простейший метод обработки гистограмм заключается в следующем: находят максимумы пиков Gi и G2-\-M, подсчитывают число клеток (площадь) в гистограмме слева от канала, соответствующего максимуму G, (п,), а также число клеток справа от канала, соответствующего максимуму G2-\-M {п2), определяют доли клеток в разных фазах:
«?, =^i 100 %; s =- NN-n-lr!4. юо %¦ а2+м=Лр 100 %,
где N — общее число клеток в гистограмме.
Этот метод успешно применяется в случае хорошего качества гистограмм (рис. 2, а), т. е. когда гистограммы имеют узкий и симметричный пик Gi, отсутствует шум в виде экспоненты и «пьедестала» (рис. 2, б), четко выражена фракция G2+M, отсутствуют дополнительные структуры, связанные с появлением поврежденных клеток (рис. 2, б).
Разработан ряд более универсальных методов математической обработки ДНК-гистограмм, позволяющих, в частности, анализировать характер распределения клеток по S-фазе [30, 31].
Динамический ПЦМ-анализ параметров клеточного цикла рассматривает изменения во времени формы ДНК-гистограммы либо при блокировании движения клеток по циклу в определенной его фазе, обычно в фазе митоза, с помощью колхицина, колцемида или винкристина (статмокинетический метод) [32, 33], либо при блокировании (обычно путем замены тимидина на БДУ) с определенного момента окраски вновь синтезируемой ДНК [34]. В результате появляется возможность проследить динамику прохождения клетками отдельных фаз клеточного цикла, определить их продолжительность в абсолютных единицах времени, а также вычленить долю непролиферирующей субпопуляции (пропись № 6).
Приготовление материала
, **
Для проведения ПЦМ-анализа необходимо приготовить суспензию одиночных клеток или исследуемых структурных компонентов клетки. Концентрация клеток, удобная для исследований, — 5 • 105— 1 • 10® клеток/мл. Необходимый для однократного анализа объем суспензии и предельная концентрация зависят от типа используемого прибора и решаемой задачи. Обычно для одномерного анализа готовят 0.5—1.0 мл суспензии с концентрацией не более 5 • 106 клеток/мл. При концентрации меньше 105 клеток/мл скорость измерений в большинстве случаев невелика — несколько десятков клеток в 1 с.
