Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
2 мг трансферрина растворяют в 2 мл карбонатного буфера (pH 9.3), добавляют 2 мг ФИТЦ на целите w перемешивают 30 мин при комнатной температуре. Затем частицы целита осаждают центрифугированием, а супернатант ’подвергают гель-фильтрации на сефадексе G-25 для отделения непрореагировавшего красителя. В полученном конъюгате обычно на одну молекулу трансферрина приходится 2—4 флюорохрома.
Для измерения pH в лизосомах интактных клеток используется ФИТЦ-декстран, который поступает в клетку за счет пиноцитоза и накапливается в лизосомах, не подвергаясь расщеплению. 300 мг декстрана-40 000 («Fluka») растворяют, при нагревании в 7.5 мл диметилсульфоксида, добавляют l^Os/tr ФИТЦ (Изомер I, «Serva») и проводят реакцию в стеклянной ампуле при 60 °С в течение 2 сут. Полученный ФИТЦ-декстран отделяют от непрореагировавшего красителя 5-кратным осаждением в холодном ацетоне и высушивают в течение 4 ч при 70 °С на воздухе.
Для приготовления флюоресцентного ’Производного МГ, получен-
ие
ного по стандартной методике из плазмы крови человека, 2 мл 0.1 %-ного раствора МГ в 0.2 М карбонатном буфере, pH 9.3, смешивают с 60 мкл !.5 %-ного раствора ФИТЦ в диметилсульфок-сиде. Реакцию проводят в течение суток при 4 °С, после чего непрореагировавший краситель удаляют диализом против фосфатного буфера (pH 7.4) в течение 3 сут с 6-кратной сменой буфера. Молярное соотношение МГ и ФИТЦ в полученном конъюгате, рассчитанное исходя из величин оптической плотности при 280 нм и 495 нм, составляет обычно 1 : 20—1 : 30.
При синтезе конъюгата с родамином 2 мл раствора МГ (5 мг/мл) в 0.2 М карбонатном буфере, pH 9.2, диализуют против раствора ТРИТЦ (0.1 мг/мл) в аналогичном карбонатном буфере в течение суток при 4 °С. Далее раствор конъюгата сутки диализуют против 0.1 М фосфатного буфера, pH 7.4, и очищают от остатков красителя на сефадексе G-25, уравновешенном 0.1 М фосфатным буфером, pH 7.4. Отношение оптических плотностей Е280/Е555 в полученных препаратах обычно составляет 1.4.
Полученные конъюгаты не токсичны для клеток и сохраняют афинность связывания с клеточными рецепторами, что позволяет использовать их для работы с живыми клетками. Кроме вышеупомянутых конъюгатов, в исследованиях, хотя и менее широко, используются флюоресцентные производные других лигандов, поступающих в клетку путем РОЭ: инсулина [8], липопротеинов низкой плотности [9], трийодотиронина [10], асиалогликопротеинов [11] и некоторых других.
Условия эксперимента
Для исследования процесса рецептор-опосредованного эндоци-тоза используют различные постоянные клеточные линии. Клетки засевают в пластиковые чашки Петри, на дне которых размещают несколько покровных стекол размером примерно 8X8 мм.
Непосредственно перед опытом стекла с монослоем клеток промывают рабочей средой (PC), состоящей из среды DME, 0.1 %-ного бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0.02 М HEPES (pH 7.4). Для того чтобы свести к минимуму количество меченого лиганда, используемого в опыте, дно пластиковой чашки Петри рекомендуется выстлать пленкой (Parafilm «М», «Serva»), на которую капают 20 мкл инкубационной среды, состоящей из PC и соответствующего лиганда. Для предотвращения высыхания капли в чашку Петри помещают мокрую вату. Стекло кладут на каплю клетками вниз. Температурный режим инкубации зависит от цели опыта. Обычно инкубацию производят сначала при 4 °С в течение 1—2 ч для синхронизации эндоцитоза, а затем клетки отмывают от несвязавшегося лиганда и переносят в теплую среду без лиганда (37°С). После инкубации стекло промывают теплым раствором Хэнкса (без красителя), прикрепляют к дну пластиковой чашки Петри с помощью пасты (Apiezon М) клетками вверх и заливают раствором Хэнкса,
Чашку со стеклом помещают или иа обычный столик микроскопа,
или на термостатируемый столик CTH-IV4.2. Объектив опускают прямо в среду к клеткам. Для быстрого просмотра препарата применяют объектив 30X0.9, водная иммерсия (в. и.). Наилучшее качество изображения получается при работе с объективом 60X1.0 (в. и.). Кроме этих высокоапертурных объективов можно рекомендовать объектив 40X0.75 (в. и.) с большим рабочим расстоянием и недавно разработанный 63X1.2 (в. и.). В ряде случаев, когда необходимо наблюдать и люминесцентное и фазовоконтрастное изображение клетки, используется объектив 90X1.25, масляная иммерсия (м. и.), модифицированный для работы в водной среде.
Необходимые приборы
При работе с флюоресцентными метками и зондами можно использовать микроскопы ЛЮМАМ различных модификаций. Флюоресценция возбуждается лампой постоянного тока ДРШ-250-2, наиболее яркой из отечественных ламп. Существенным моментом является подбор оптимальных фильтров для возбуждения флюоресценции красителей при решении определенных задач эксперимента. Для создания наборов фильтров целесообразно пользоваться набором оптического стекла и наборами интерференционных фильтров отечественного производства или зарубежных фирм. При подборе фильтров необходимо учитывать спектр свечения ртутной лампы, спектр возбуждения флюоресцентной метки, спектральные характеристики фильтров, а также спектр собственной люминесценции клетки. В таблице представлены некоторые комбинации филь'тров, «сконструированные» только из отечественных светофильтров. Кроме того, можно рекомендовать набор № 18, состоящий из интерференционного фильтра Кр 490 (К. Ц. Й.), фильтров СЗС-22-2 и ЖС-17-2 для создания узкого канала пропускания с длиной волны 490 нм и высокой эффективностью пропускания. В таблице указаны, кроме обычных светоделительных пластинок, «Зеленая-2» и «Зеленая-З», включенные в комплект нового микроскопа ЛЮМАМ-Р8. Отметим, что при подборе комбинаций фильтров нельзя ограничиваться сведениями о характеристиках фильтров, представленными в описаниях; необходимо получить кривые пропускания для каждого отдельного фильтра и для всего набора фильтров.
