Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
В комплект включены плазмиды рА132, рМа13 и pMh9, содержащие специфичные фрагменты геномов трех видов микоплазм, часто инфицирующих клеточные культуры: Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini, M. hominis. Нами были сконструированы плазмиды по стандартной методике [65]. Доказательства их специфичности в качестве зондов, т. е. отсутствие перекрестной гибридизуемости с ДНК других микоплазм и с ДНК клеток эукариот (в 1000-кратном избытке), представлены в отдельной статье [66].
Для обнаружения и идентификации микоплазменных контаминаций рекомендуется следующая последовательность операций.
1. Клетки контролируемой культуры снимаем с поверхности стекла или пластика с помощью резинового шпателя и собираем центрифугированием.
2. Из осадка клеток выделяем ДНК по стандартной методике. Клетки вскрываем в 1.5 М растворе NaCl с добавлением 1 % до-децилсульфата Na (SDS), проводим один цикл депротеинизации хлороформом, затем переосаждение этанолом и обработку протеина-зой К-
.•• ® • * •
1 2 3 4-56
Обнаружение и идентификация микоплазм в культурах клеток методом ДНК-гибриди-зации с последующей радиоавтографией.
Каждая из пяти полос (а—д) содержит по 6 одинаковых проб: / — 2 мкг ДНК мыши,
2 — 0.02 мкг ДНК A. laidlawu-\-2 мкг ДНК мыши, 3 — 0.02 мкг ДНК М arginini-\-2 мкг ДНК мыши, 4 — 0.02 мкг ДНК М. hominis+2 мкг ДНК мыши, 5 и б — по 2 мкг ДНК из клеток ЗТЗ Balb и HeLa, спонтанно коитамииированных микоплазмами. В качестве зондов использованы плазмиды, мечеииые 32Р в реакции иик-траисляции: а — рМа!3, б — рМИ9, в — рА132, г — смесь плазмид (рМа I3+pMh9+pA132), д — универсальная плазмида pMg 16. Сравнение автографов позволяет установить, что обе культуры (5 и 6) были коитамииироваиы A. laid-lawii.
3. ДНК в количестве, эквивалентном 105—10е исходного числа клеток, денатурируем, смешивая с двойным объемом щелочного раствора (0.5 М NaOH, 1.5 М NaCl), через 10 мин нейтрализуем, добавляя 4-кратный объем буфера (1.5 М Трис-НС1, 3 М NaCl, pH 7.4), затем разбавляем в 2 раза 20-кратным раствором SSC (1-кратный SSC — 0.15 М NaCl и 0.015 М цитрат Na) и переносим на нитроцеллюлозный фильтр, используя капилляр или микроворонки. Фильтр промываем 2-кратным SSC, затем 70 %-ным этанолом и фиксируем нагреванием в вакуумном шкафу до 75—80 °С 2—3 ч. Фильтры с образцами ДНК можно использовать немедленно или хранить.
4."Плазмиды, несущие специфические фрагменты ДНК микоплазм, метим 35Р в реакции ник-трансляции по стандартной методике, [65]. Для серии опытов достаточно 0.8 МБк одного из четырех дез-оксинуклеотидтрифосфатов и 0.2—0.3 мкг ДНК плазмиды.
5. Гибридизацию ДНК на фильтрах с радиоактивными плазмид- , ными зондами (отжиг) проводим в запаянных полиэтиленовых мешочках при температуре 65 °С в 6-кратном SSC с 0.5 %-ным SDS. Фильтры после отжига промываем 6-кратным раствором SSC при комнатной температуре, затем 2—5 ч в 6-кратном растворе SSC , с 0.5 %-ным SDS при 65 °С (на качалке) и в 3 • 10_3 М Трис-буфере, pH 9, при комнатной температуре, затем сушим на воздухе и экспонируем с рентгеновской пленкой РМ-1 в течение 1 сут.
Результаты подобного анализа с разными плазмидами-зондами и их смесью при соответствующих контролях показаны на рисунке.
Плазмидные зонды для выявления контаминации клеточных культур микоплазмами сконструированы уже несколькими исследовательскими группами [67—71]. Применение гибридизационного метода в описанной нами модификации ограничено теми лабораториями, где возможна работа с радиоактивными изотопами. Развитие этого метода и его более широкое распространение связывают с заменой радиоактивной метки на ферментную, т. е. с использованием щелочной фосфатазы или пероксидазы хрена, которые могут быть «пришиты» к плазмидным зондам с помощью биотин-авидиновых комплексов.
Методы деконтаминации клеточных культур
от микоплазм
Несмотря на то что с момента обнаружения микоплазм в клеточных культурах прошло около 30 лет, проблема деконтаминации продолжает оставаться весьма актуальной. Здесь мы обобщаем данные основных опубликованных в последние годы работ, а также результаты собственных исследований и даем рекомендации по использованию наиболее эффективных на наш взгляд методов деконтаминации.
В литературе неоднократно появлялись сообщения об использовании штерхностно-активных веществ для деконтаминации клеток. Известно, что микоплазмы чувствительны к действию катионных и анионных детергентов, однако почти все вещества весьма токсичны для клеток. Из семи наименее токсичных для клеток неиоиных детергентов Тритон WR-1339 оказался наиболее эффективным — клетки оставались свободными от микоплазм в течение 7 мес [72]. Катионные детергенты, испытанные нами, подавляли рост микоплазм в агаре, однако при обработке ими клеток положительные результаты были получены лишь в одном случае (клетки ЗТЗ-Balb) — при выдерживании суспензии клеток в растворе роккала (1 мг/мл) в течение
7—10 мин. Подобную обработку повторяли на протяжении трех пассажей.
