Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Культуры просматривают под микроскопом на наличие цитопати-ческих изменений и феномена гемадсорбции по методике, описанной в разделе контроля клеточных культур. Сыворотка считается свободной от вирусов при отсутствии дегенеративных изменений и гемадсорбции.
ВОЗ для этой цели рекомендует использовать первичную культуру тестикул быка или клетки перевиваемых линий почек быка, которые чувствительны.! к вирусам крупного рогатого скота и особенно к вирусу диареи [?8].
Метод испытания сыворотки в культуре'первичных клеток тести* кул быка состоит в следующем: клеточную суспензию в объеме 90 мл смешивают с 10 мл испытуемой сыворотки и высевают в два флакона. Такое же количество клеток засевают в качестве контроля, взяв’вместо испытуемой контрольнукпаыворотку, не содержащую вирусов крупного рогатого скота (сто данным предварительного контроля). Опытные и контрольные культуры инкубируют при 37 °С±1 °С в течение 28 сут, проводя многочисленные микроскопические исследования на наличие цитопатических изменений клеточного монослоя. По мере надобности ростовую среду можно менять на свежую, содержащую соответствующую сыворотку.
В течение-периода наблюдения проводится однократное субкультивирование клеток, выращиваемых в среде, содержащей как испытуемую, так и контрольную сыворотку, чтобы обеспечить рассев клеток минимум на 6 флаконов.
В конце периода наблюдения проводят следующие испытания (по одному флакону на каждое):
1) суперинфицирование цитопатогенным штаммом вируса диареи крупного рогатого скота (клетки должны быть чувствительны к ви-русу);
2) окраска клеток методом Мэя—Грюнвальда—Гимзы для выявления нарушения морфологии клеток;
3) гемадсорбция со смесью эритроцитов (по 0.2 %) кур, морских свинок и человека (группы 0);
4) электронно-микроскопическое исследование негативно-кон-трастированных экстрактов клеток, полученных после их разрушения и осветления суспензии;
5) иммунофлюоресцентное исследование (прямым и непрямым методом) на отсутствие вируса диареи крупного рогатого скота.
Сыворотка считается свободной от вирусов, если они не обнаруживаются ни одним из перечисленных тестов.
По нашему опыту, наиболее удобным методом контроля сыворотки является тестирование на индикаторных линиях перевиваемых Клеток с последующим иммунофлюоресцентным анализом.
Электронно-микроскопический контроль. Возможны следующие электронно-микроскопические методы контроля на наличие посторонних вирусов.
1. Метод негативного контрастирования. В случае формирования в растущих культурах цитопатических изменений или других выраженных изменений характера роста и морфологии клеток возможно проведение простого и быстрого контроля на наличие посторонних агентов [33]. Для этого используется культуральная жидкость либо непосредственно, либо вместе с клетками, механически снятыми со стекла и подвергнутыми замораживанию и оттаиванию. После осветления центрифугированием на низких скоростях из надосадоч-ной жидкости готовят препараты. Наиболее широко применяется капельный метод: на предметное стекло, покрытое парафином, помещается капля исследуемой жидкости объемом 5—6 мкл; под каплю на 30—4б‘ 'с вносится сетка, покрытая формвар-углеродной пленкой, для адсорбции материала из жидкости, после чего она переносится на фильтровальную бумагу, избыток жидкости впитывается, и сетка подсушивается на воздухе.
Препарат годится для анализа в том случае, если концентрация агента в жидкости не ниже 104 частиц в 1 мл. В противном случае можно прибегнуть к дополнительной концентрации агента из этой жидкости путем скоростного центрифугирования в режиме, обеспечивающем осаждение частиц диаметром 30—40 нм (40 000 g в течение 1.5 ч). Полученный осадок ресуспензируется вначале в небольшом объеме буфера или дистиллированной воды, а затем делаются кратные разведения, из которых готовятся препараты капельным методом. При электронно-микроскопическом исследовании отбираются и анализируются сетки с оптимальным распределением и окрашиванием материала.
Рекомендуются два основных контрастирующих вещества, позволяющих хорошо выявлять структурные особенности изучаемых агентов при первоначальном анализе: фосфорновольфрамовая кислота и уксуснокислый уранил (уранилацетат).
Существует обширная литература по многочисленным модификациям и перспективам применения метода негативного контрастирования (см. обзоры [34, 35]).
2. Метод ультратонких срезов. Самым надежным следует считать
но
метод ультратонких срезов клеток. Он наиболее приемлем в тех случаях, когда продукция вирусов клетками либо незначительна, либо формирующийся вирус не покидает клетку и не может по этой причине быть обнаружен в культуральной жидкости. Ряд агентов при выходе из клетки быстро подвергается деструктивным изменениям или не может быть достоверно идентифицирован при негативном окрашивании в силу своих структурных особенностей.
Кроме того, нельзя забывать, что подавляющее большинство клеточных систем, полученных от млекопитающих и птиц, содержит эндогенные ретровирусы. Поэтому всякий контроль должен подразумевать наличие возможных ассоциаций агентов, которые могут взаимодействовать друг с другом на уровне одной клетки культуры ткани [15, 36].
