Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Для исследования контролируемых образцов клеток на отсутствие цитопатогенных вирусов пробы культуральной жидкости со всех испытуемых флаконов объединяют (сливая равные объемы) и вводят из расчета 1 часть контролируемой смеси проб (но не менее 10 мл на каждую клеточную культуру) и 4 части питательной среды в три различные клеточные тест-культуры — в гомологичную культуру другой партии клеток, в культуру клеток человека (предпочтительно в первично-трипсинизированную или диплоидную) и в клеточную культуру, наиболее чувствительную для выявления вирусов — возможных контаминантов испытуемой культуры. От каждой клеточной культуры оставляют по одному незараженному флакону. Контрольные и инокулированные культуры инкубируют при 37 °С±1 °С в течение 14 сут с однократной сменой среды (в случае необходимости) на 4—6-е сутки после инокуляции.
Культуры считаются прошедшими испытания, если в опытных и контрольных культурах отсутствуют цитопатические изменения и гемадсорбция, а в культуральной жидкости — гемагглютинирующие агенты. При наличии цитопатических изменений и (или) гемадсорбции и гемагглютинации в контрольных флаконах опыт следует повторить на клеточных культурах, полученных из других источников.
Контроль на лабораторных животных. Испытания проводятся только на здоровых животных, не использовавшихся ранее в эксперименте. Для выявления посторонних агентов в клеточных культурах необходимо ввести внутримышечно 107 жизнеспособных клеток поровну каждому животному следующих групп: мышам-сосункам двух пометов (не менее 10 животных в каждом) не старше 24 ч, 20 мышам
массой 15—20 г, 5 морским свинкам массой 300—350 г, 5 кроликам массой 2.5—3.0 кг.
За животными следует наблюдать не менее 28 сут. Все животные, которые погибают позднее 24 ч после инокуляции или у которых наблюдаются признаки заболевания, должны быть вскрыты и исследованы макроскопически на наличие признаков вирусной инфекции. Из соответствующих органов готовят 10 %-ную суспензию на
0.85 %-ном растворе NaCl и вводят ее не менее чем 5 одноименным животным в мозг и в брюшную полость. За инокулированными животными наблюдают 14 сут.
Клеточные культуры считаются прошедшими этот вид контроля, если на протяжении периода наблюдения остаются здоровыми не менее 80 % инокулированных животных и ни у одного из них не наблюдается признаков вирусного заболевания. Допускается отход животных (до 20 %) от случайных причин, не связанных с проявлениями каких-либо инфекционных заболеваний.
Контроль на куриных эмбрионах. Контролю подвергается не менее 106 жизнеспособных клеток, которые вводят трем группам куриных эмбрионов по 10 в каждой группе.
Первой группе эмбрионов 9—10-суточного возраста материал вводят по 0.25 мл в аллантоисную полость. Эмбрионы инкубируют при 37°С±1°С в течение 5—6 сут. По истечении указанного срока аллантоисную жидкость собирают индивидуально от каждого эмбриона и проверяют в реакции гемагглютинации с эритроцитами морской свинки и петуха. При этом в лунках агглютинационных планшетов готовят 3—4 последовательных разведения (0.85 %-ным раствором*Na) аллантоисной жидкости из каждого инокулирован-ного эмбриона. Затем в лунки добавляют равные объемы 0.5 %-ной взвеси эритроцитов (на 0.85 %-ном растворе Na). После 30—40 мин инкубации при 20—25 °С (после оседания эритроцитов в контрольных лунках) учитывают результаты. Материал считается прошедшим контроль, если в течение указанного срока инкубации остаются живыми не менее 80 % инокулированных эмбрионов и реакция гемагглютинации во всех случаях оказывается отрицательной.
Второй группе эмбрионов 7—8-суточного возраста то же количество клеток вводят в желточный мешок (по 0.25 мл). Эмбрионы инкубируют при 37°С±1°С в течение 10 сут. Клетки считаются прошедшими этот вид контроля, если к концу указанного срока инкубации остаются живыми не менее 80 % инокулированных эмбрионов.
Третьей группе эмбрионов 10—11-суточного возраста материал вводят по 0.2 мл на хорион-аллантоисную оболочку с боковой поверхности эмбриона через искусственно созданную воздушную полость. Эмбрионы инкубируют при 37 °С±1 °С в течение 5—6 сут. По истечении указанного срока инкубации должны остаться живыми не менее 80 % инокулированных эмбрионов при отсутствии на хорион-аллантоисных оболочках макроскопических изменений.
Контроль сыворотки крови. Сыворотка крови, используемая для выращивания клеточных культур, должна быть свободна от вирусной
контаминации. Учитывая технологию получения (сыворотки при забое животных, следует иметь в виду возможную ее контаминацию также различными бактериями, грибами, микоплазмами [20—32].
В СССР для выявления вирусной контаминации сыворотки крупного рогатого скота контроль производят на пецвично-трипсинизи-рованных культурах клеток почек и тестикул эмбрионов коррв в объеме не менее 25 мл от всего объема серии, которые вводят в удобные для проведения контрольных испытаний флаконы так, чтобы разведение испытуемого материала в= с-реде не превышало
1 :4 из расчета не менее 3 см2 площади клеток на 1 мл сыворотки. Культуры инкубируют при 37 °С±1 °С в течение 14 сут. На протяжении срока интеуб'ации культуру клеток^ просматривают на наличие цитодеструктивныхчизменений. По окончании этого срока клеточный монослой разрушают однократным замораживанием и оттаиванием, после чего 25 мл полученного материала беа предварительного центрифугирования вносят в клеточные культуры’того же вида и инкубируют их в течение 14 сут приг37°С±1 °С.
