Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Амидоловый проявитель готовят перед употреблением (амидол —
0.3 г, ЫагСОз — 1 г, лимонная кислота — 0.05 г, дистиллированная вода — 100 мл) и фильтруют через слой ваты. Препараты проявляют
3 мин при комнатной температуре, промывают 1—2 мин водой, фиксируют в 40 %-ном растворе тиосульфита натрия 5 мин, промывают 20 мин в проточной воде и окрашивают гематоксилин-гемалауном или гематоксилин-эозином. После окраски препарат промывают водой, проводят через 3 смены 96 %-ного спирта и 3 смены ксилола (по 0.5—1 мин), заключают в бальзам и. просматривают в световом микроскопе.
Иммунофлюоресценция. Этот метод чаще всего применяется для обнаружения трудно культивируемых микоплазм (Mycoplasma hyorhinis, М. orale, М. fermentans), как правило, в сочетании с методом индикаторных культур [17, 53].
При «прямой иммунофлюоресценции» на препарат наносится
гипериммуниая сыворотка, меченная флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), затем следует промывание в фосфатиом буфере и высушивание. Препараты монтируют и просматривают в люминесцентном микроскопе.
Для «непрямой иммунофлюоресценции» препарат обрабатывают рабочим раствором, содержащим антикроличий глобулин, меченный ФИТЦ, и бычий альбумин, меченный родамином.
Этот же метод в сочетании с микробиологическим используют для идентификации микроколоний микоплазм на поверхности твердой питательной среды. Естественно, что для применения метода иммунофлюоресценции необходимо иметь достаточно полный набор гипер-иммунных антисывороток.
Биохимические методы. Методы основаны на выявлении активности ферментов, характерных для микоплазм, или на выявлении изменений в метаболизме клеток, возникающих вследствие мико-плазменной инфекции. Первичная диагностика, позволяющая различить микоплазмы, способные разлагать глюкозу или аргинин и соответственно сдвигать pH среды в кислую или щелочную область, состоит в простом добавлении к среде цветного индикатора [54].
К биохимическим методам иногда относят и авторадиографию, описанную в предыдущем разделе, так как преимущественное включение 3Н-тимидина микоплазмами связано с действием специфически микоплазменного фермента нуклеозидфосфорилазы, превращающей тимидин в тимин, и со способностью микоплазм активно включать тимин, в то время как все клетки млекопитающих тимин практически не включают [55].
Наиболее распространенный из биохимических методов также основан на выявлении действия микоплазменной нуклеозидфосфорилазы, катализирующей превращение уридина в урацил. При этом микоплазма в отличие от клеток млекопитающих быстро включает урацил в свою РНК, и количественные соотношения меченых уридина и урацила в контаминированной культуре и культуре, свободной от микоплазм, оказываются резко различными [56]. Удобная модификация этого метода состоит в использовании уридина и урацила, меченных разными изотопами (3Н и 14С), с последующим дифференциальным счетом радиоактивности в кислотонерастворимой фракции РНК с помощью сцинтилляционного спектрофотометра [57].
ДНК—ДНК-гибридизация. Заражение клеточных культур микоплазмами может быть определено по гибридизуемости ДНК, выделенной из проверяемых культур, с рекомбинантными плазмидами, содержащими фрагменты ДНК микоплазм. Эти плазмиды-зонды практически не гибридизуются с ДНК эукариот. Гибридизация зондов с ДНК микоплазм является видоспецифичной, поэтому комплект соответствующих зондов позволяет не только обнаружить микоплазмы в культуре клеток эукариот (или в любом другом биологическом материале), но и определить вид микоплазмы, оценить множественность инфекции. Плазмида, содержащая фрагмент рибосомного оперона одной из микоплазм, может служить универсальным зондом для определения любой микоплазменной или бактериальной конта-
минации. Абсолютная чувствительность метода при использовании зондов, меченных 32Р, в реакции ник-трансляции с последующей радиоавтографией составляет около 1 нг микоплазменной ДНК, что соответствует примерно 106 клеток микоплазмы.
Отсутствие заметной гомологии между ДНК многих микоплазм было отмечено еще в работах конца 60-х годов [58—60]. По более точным количественным данным перекрестной гибридизации ДНК разных микоплазм в растворах было установлено, что гомология по ДНК у большинства видов не превышает 2 %, и только у нескольких пар сравниваемых микоплазм гомология составила от 4 до 21 % [61—63]. В нашей работе [64] по перекрестной блот-гибридизации ДНК ряда микоплазм показано, что при низком уровне гомологии ДНК исследованных видов эта гомология касается отдельных протяженных фрагментов генома, а не коротких участков, распределенных по всей его длине. Более того, у некоторых микоплазм единственными гомологичными участками ДНК оказываются рибосомные гены.
На основании этих результатов мы начали использовать в качестве гибридизационных зондов для обнаружения и идентификации микоплазм тотальные препараты ДНК, полученные из микоплазм, выращенных на специальных средах. Такие зонды оказались высокоэффективными и достаточно специфичными, но их нельзя рекомендовать к широкому применению, так как получение чистых культур микоплазм и их выращивание в препаративных количествах связаны со значительными техническими трудностями. В связи с этим мы предприняли клонирование случайных рестриктазных фрагментов ДНК микоплазм в бактериальной плазмиде pBR322 и проверку рекомбинантных Ь*лазми5, на специфичность в опытах по блот- и дот-гибридизации с ДНК различных микоплазм и ДНК клеток эукариот. Был составлен комплект плазмид-зондов, содержащих фрагменты ДНК, видоспецифичные для каждой из взятых микоплазм. В дальнейшем этот комплект должен быть расширен.
