Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Уже давно был предложен метод деконтаминации клеточных культур с помощью аитимикоплазменных гипериммунных сывороток [73, 74]. Имеется сообщение о возможности деконтаминации клеточных культур с помощью неиммунных сывороток кроликов и морской свинки, вносимых (10 %) в среду культивирования на протяжении 2—4 пассажей. Микоплазмоцидное действие оказывал комплемент, действующий по альтернативному пути, поскольку после прогревания сыворотки и нейтрализации фактора С-3 комплемента антисывороткой нужного эффекта не наблюдали. Аналогичные данные были получены нами при экспериментальной инфекции клеток линии К-562 при внесении в среду культивирования свежей сыворотки человека (20%). Было установлено, что разные виды микоплазм обладают различной чувствительностью к комплементу, что, по-видимому, определяется различиями в составе их цитоплазматических мембран.
Оригинальный метод деконтаминации культур клеток состоит в пассировании их на бестимусных мышах [75—77]. Механизм деконтаминации клеток в бестимусных мышах остается пока неизвестным. Однако в организме мыши введенные контаминированные клетки окружены большим количеством макрофагов, которые, вероятно, и играют основную роль в деконтаминации. При внесении в культуру макрофагов контаминированных клеток в соотношении 1 : 100 (клетки : макрофаги) с добавлением антибиотиков были де-контаминированы 10 линий клеток [78]. В наших экспериментах при использовании данного метода удалось лишь значительно снизить титр микоплазм [79].
Известно, что молекулы ДНК в присутствии интеркалирующих красителей весьма чувствительны к фотодинамическому действию света. На этом основан еще один метод деконтаминации клеточных кулйтур от микоплазм [80]. В культуру контаминированных микоплазмами клеток вносят 5-бромурацил, который поглощается преимущественно микоплазмами, а не клетками; затем — краситель Hoechst-33258, после чего клетки облучают УФ-светом (люминесцентная лампа холодного свечения), что приводит к разрывам в ДНК. Освобождение клеток от микоплазм в наших опытах достигалось в результате ежедневного облучения в течение 5 сут по 30 мин. Затем клетки клонировали и проверяли на наличие микоплазм различными методами. Для обеспечения избирательного включения 5-бромура-цила или бромдезоксиуридина в ДНК микоплазм, а не клеток хозяина было предложено [81] проводить обработку клеток в условиях, тормозящих прохождение ими клеточного цикла. Для этого до внесения в среду предшественников синтеза ДНК клетки выдерживали в среде Игла без глютамина или с добавлением бутирата натрия. В наших экспериментах для полной деконтаминации клеток от микоплазм требовалось провести 2—3 цикла подобной обработки [79].
Имеется недавнее сообщение о возможности деконтаминации клеток Hoechst-33258, который вносили в среду в концентрации 2—8 мкг/мл на 24 ч с повторением обработки через 3 сут [82].
Многолетнее использование антимикоплазменных антибиотиков как для деконтаминации, так и для повседневного культивирования привело к появлению штаммов микоплазм, устойчивых к этим антибиотикам. Так,тилозин, линкомицин, канамицин и гентамицин в настоящее время уже не способны полностью освободить клетки от микоплазм. Увеличение дозы этих антибиотиков, обработка клеток при повышенной температуре (41 °С), применение гипотонического шока и трицинового буфера приводят лишь к снижению степени контаминации. Такие клеточные линии с заглушенной микоплазменной инфекцией, принимаемой за чистые, могут являться дополнительным источником контаминации чистых клеточных линий. Тем не менее постоянно появляются сообщения о деконтаминации линий клеток с помощью новых антибиотиков. Тиамутин (10 мкг/мл) и миноциклин (5 мкг/мл) были успешно использованы для деконтаминации клеток от спонтанной и экспериментальной микоплазменной инфекции. Обработку проводили в течение 4—5 нед, затем клетки клонировали
и проверяли на присутствие микоплазм [83]. Клетки Vero удалось деконтаминировать лишь при одновременном применении мино-циклина, антимикоплазменной сыворотки и комплемента [84]. Опубликовано сообщение о деконтаминации четырех клеточных линий в присутствии 15 мкг/мл тетрациклина и 500 мкг/мл канами-цина с последующим клонированием. Суспензию клеток разводили до
1 клетки на лунку, среду меняли каждые 2—3 сут из-за нестабильности тетрациклина; через 2 нед клетки переводили на среду без антибиотиков, и клоны росли еще 21—56 сут, пока становилось возможным тестирование инфекции [85].
Взяв за основу эту методику, мы попытались деконтаминировать клетки HeLa-M. и МХ-7 клонированием на 96-луночных пластинах в присутствии тилозина (120 мкг/мл), линкомицина (500 мкг/мл) и канамицина (400 мкг/мл). Обработка клонов в течение 4 нед со сменой среды каждые 2—3 сут не привела к успеху. Деконтаминация удалась только с помощью антибиотиков доксициклина (10 мкг/мл), метациклина (10 мкг/мл) и гентамицина (400 мкг/мл). Обработку единичных клонов проводили в течение 4 нед со сменой среды каждые 2—3 сут, затем клоны переводили на среду без антибиотиков, которую также меняли каждые 2—3 сут в течение 2—3 нед. После подрастания клонов их пересевали на 24-луночные пластины и проводили тестирование микробиологическим методом, окрашиванием Hoechst-33258, авторадиографией [79, 86].
