Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Для культивирования микоплазм предложены различные стандартные полутвердые и жидкие среды [44]. Разные авторы обогащают их различными дополнительными компонентами, однако наличие в среде лошадиной сыворотки и дрожжевого экстракта — непременное условие успешного культивирования. Агар, бульон, лошадиную сыворотку и прочие компоненты среды предварительно проверяют на способность поддерживать рост микоплазм и на отсутствие токсичности. Для контроля среды рекомендуется использовать музейные, трудно культивируемые штаммы (Mycoplasma hyorhinis, М. orale, М. fenmentans).
Было показано, что наилучшие результаты при первичном выделении.микоплазм из клеточных культур удается получить, культивируя чашки в атмосфере смеси 5 % СОг и 95 % N2 [45]. Позже эти данные были подтверждены многими исследователями.
Электронно-микроскопический контроль. Метод позволяет определить микоплазменную контаминацию культур только в ультратонких срезах. Техника негативного контрастирования в данном случае неэффективна, так как не позволяет дифференцировать полиморфные клетки микоплазм от субклеточных структур и элементов поверхности клетки-хоаяин а.
Рекомендуется способ ускоренной обработки клеток в моиосяое или суспензии для электронно-микроскопического исследования в ультратонких срезах по прописи, данной в предыдущем разделе.
Клетки микоплазм чрезвычайно полиморфны. Они могут быть шарообразными, нитевидными, ветвящимися, их размеры варьируют в широких пределах (от 100 нм до 2 мкм в длину и диаметром от 50 нм до 1 мкм). Клетки окружены цитоплазматической мембраной, имеющей асимметричный профиль. Общая толщина мембраны равняется 16—18 нм, из них 10 нм приходится на собственно мембрану и 6— 8 нм на наружный (экстрамембранный) ворсинчатый слой.
Мембрана микоплазм и тончайшая сеть нитей дезоксирибо-нуклеопротеина являются основными морфологическими признаками, позволяющими отличить микоплазмы от субклеточных структур клетки-хозяина.
Среди микоплазм иногда обнаруживается значительное количество так называемых элементарных телец — минимальных репродуктивных клеток. Они представляют собой осмиофильные образования шаровидной формы, окруженные характерной мембраной. Размеры этих образований варьируют в пределах 0.2—1.5 мкм." Их внутреннее содержимое чаще всего представлено плотным гомогенным материалом. В связи с этим элементарные тела микоплазм трудно отличить от зрелых внеклеточных вирионов онкогенных РНК-содержащих ретровирусов типа С [46]. Особенная осторожность требуется при интерпретации данных в клеточных культурах, полученных от грызунов и птиц.
Использование индикаторных клеточных линий. Некоторые, так
называемые «некультивируемые виды» микоплазм (например, Mycoplasma hyorhinis) плохо растут на бесклеточных средах. Для их выявления рекомендуется использовать индикаторные клеточные культуры: культуры перевиваемых клеток почки обезьяны Vero, почки хомяка ВНК-21 и эмбрионов мышей Swiss ЗТ6, свободные от мико-плазм-контаминантов [44]. Указанные культуры клеток выращивают в сосудах на покровных стеклах и инфицируют контролируемыми клетками или культуральной жидкостью от них. Через 3—4 сут культивирования, когда титр микоплазм достигает максимальной величины, культуры клеток на стеклах подвергают последующему цитологическому, иммунофлюоресцентному или биохимическому исследованию.
Окраска флюорохромами. Метод основан на выявлении ДНК с помощью флюорохромов. Впервые окрашивание флюорохромами для обнаружения микоплазменной контаминации клеточных культур было применено в сочетании с. люминесцентным вариантом реакции Фельгена [47]. Затем были использованы и другие флюорохромы, применяемые при изучении метафазных хромосом эукариот: акри-флавин, диамидинофенилиндол, обозначаемый обычно DAPI [48], краситель Hoechst-33258 [48], оливомицин [49].
Для окрашивания флюорохромами клетки выращивают на покровных стеклах 48—72 ч, трижды отмывают физиологическим раствором или фосфатным буфером (pH 7.2) и фиксируют либо в смеси метанола и ледяной уксусной кислоты (3: 1), либо в 70 или 96 %-ном этиловом спирте.
Для анализа препаратов требуется люминесцентный микроскоп. Обычно йспользуется 1000-кратное увеличение, объективы с масляной иммерсией. В контаминированных культурах микоплазмы обнаруживаются в виде мелких (0.1—0.3 мкм диаметром) гранул, расположенных вне клеток или на поверхности клеточной мембраны. Часто наблюдаются скопления гранул. По нашим данным н данным других исследователей [17, 50, 51], метод позволяет обнаруживать микоплазмы даже при сравнительно низкой множественности инфекции и его чувствительность может быть повышена при использовании индикаторных клеточных линий. Однако основными преимуществами метода окраски флюорохромами являются относительная простота и возможность получить ответ в течение часа.
1. Окраска Hoechst-33258. Препарат фиксируют в смеси метанола и ледяной уксусной кислоты, добавляя 3—4 капли фиксатора в культуральную среду на 2—3 мин. Затем среду удаляют, добавляют свежий фиксатор и фиксируют еще 5 мин. Препарат высушивают на воздухе и наносят на 10—15 мин раствор красителя, потом дважды промывают в дистиллированной воде и высушивают.
