Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Основной раствор красителя готовят растворением 0.5 мг реактива в 10 мл дистиллированной воды (срок хранения при 4 °С до года). Рабочий раствор готовится в растворе Хэнкса без индикатора в концентрации 0.05 мкг/мл непосредственно перед употреблением.
При длине волны возбуждающего света 360 им (ртутная лампа 114 1
высокого давления с фильтрами, обеспечивающими максимум пропускания в области 360—400 нм) максимумом флюоресценции красителя с ДНК соответствует приблизительно 470 нм. Флюоресценцию комплекса наиболее удобно наблюдать с фильтрами, исключающими свечение с длинами волн ниже 460 нм. В этих условиях на препаратах клеток, свободных от микоплазм, наблюдается изумрудно-зеленое свечение ядра, а цитоплазма почти не светится.
2. Окраска DAPI. При этом методе можно окрашивать как фиксированные, так и живые клетки. Краска готовится на фосфатном буфере (pH 6.5—7.0) с концентрацией 50 мкг/мл и хранится при 4 °С полгода. Рабочий раствор готовится непосредственно перед употреблением, концентрация 0.1 мкг/мл. При окраске живых клеток в пробирки со стеклами вносят 3 мл красителя, пробирки инкубируют 15—30 мин при 37 °С, затем дважды отмывают фосфатным буфером и просматривают в люминесцентном микроскопе. Для фиксации используют 96 %-ный этиловый спирт или смесь метанола и ледяной уксусной кислоты (3: 1). Длительность окраски такая же, как и для живых клеток. Как и при окраске Hoechst-33258, флюоресцируют и ядра, и микоплазмы, иногда заметно слабое свечение цитоплазмы.
3. Окраска оливомицином. Клетки фиксируют в 70 или 96 %-ном этиловом спирте 15—20 мин. Раствор оливомицина наносят на препараты в темноте при комнатной температуре на 30—60 мин. Затем стекла дважды промывают в дистиллированной воде, высушивают и просматривают в люминесцентном микроскопе. Рабочий раствор оливомицина (20 мкг/мл) готовят на дистиллированной воде с добавлением 0.02 М Mg++ (MgCh или MgSO-t). При 4 °С раствор может храниться до полугода.
4. Окраска акрилфлавином или акридиновым оранжевым несколько более трудоемка, чем окраска предыдущими флюорохро-мами, но мы все же считаем целесообразным ее привести.
Культуру клеток, выращенную на покровных стеклах, дважды отмывают фосфатным буфером (pH 7.2), клетки фиксируют 10 мин в 4 %-ном формальдегиде. Затем препараты дважды отмывают в дистиллированной воде, проводят гидролиз РНК (погружение на 10 мин в 1 н. НС1 при 60 °С), снова дважды промывают дистиллированной водой и окрашивают 20 мин раствором Шиффа. После окраски препараты дважды промывают дистиллированной водой, погружают в 70 %-ный спирт, а затем проводят через 20-, 40- и 70 %-ный спирт и дважды (в течение 5 мин) промывают смесью 7 частей абсолютного спирта и 3 частей 1 н. НС1. Монтировать препараты можно как с глицерином, так и с водой.
Реактив Шиффа готовится следующим образом: 250 мг акридинового оранжевого или акрилфлавина и 500 мг метабисульфита калия растворяют в 250 мл воды и добавляют 20 мл 1 н. НС1. Колбу с раствором герметически закрывают и оставляют в темноте при 4 °С на 3 сут (каждые 24 ч колбу рекомендуется встряхивать). Раствор можно хранить при 4 °С в течение месяца, перед использованием его фильтруют через стеклянный фильтр № 4 под давлением, первую небольшую порцию выбрасывают.
Авторадиография. В 1965 г. появилось сообщение о том, что клетки, контаминированные микоплазмами, в значительной мере утрачивают способность включать меченый тимидян в ядра. На этих же препаратах почти вся метка обнаруживалась в микоплазмах [52]. Этот результат послужил основанием для последующего использования метода авторадиографии при определении микоплазменной контаминации клеток [20, 45, 51J,.
Клетки выращивают на покровных стеклах в течение 48 ч с последующей заменой культуральной среды на свежую, содержащую
0.2 МБк/мл 3Н-тимидина и инкубируют в течение 2.5"— Зч при 37 °С. Затем избыток тимидина отмывают немеченым тимидином (50 мг/мл в растворе Хэнкса) дважды по 15 мин при 37 °С. Препарат фиксируют в жидкости Карнуа от 30 мин до 1.5 ч, проводят 2 раза по 5 мин через 96 %-ный спирт и оставляют на ночь в 70 %-ном спирте (можно дольше). Затем препараты проводят через абсолютный спирт, высушивают, заключают в бальзам (клетками вверх) на предметном стекле и выдерживают 24—48 ч до высыхания бальзама. Все дальнейшие процедуры, связанные с покрытием преиаратов фото-чувствительной эмульсией, их экспозицией и проявлением, проводят при слабом желто-зеленом свете (фильтр № 117). Качество радиоавтографов в значительной мере определяется качеством эмульсии. При использовании эмульсий типа «Р* и «М» вводят растворы пластификатора и дубителя (пластификатор: 96 %-ный спирт — 30 мл, глицерин— 12 мл, на 100 мл эмульсии— 4.2 мл пластификатора; дубитель: 10 %-ный водный раствор ацетата
хрома — 5 мл, 4 %-ный водный раствор ЫагСОз — 5 мл, дистиллированная в'ода — 5 мл, на 100 мл эмульсии 1.2 мл дубителя). Эмульсию расплавляют на водяной бане (до 40 °С), вйодят теплые растворы пластификатора и дубителя, разводят бромистой водой (10 %-ный КВг — 0.2 мл на 100 мл воды), наносят на препарат эмульсию «Р» (1:1) или «М» (1:2) и оставляют на 1;—2 ч при комнатной температуре. После высыхания эмульсии препараты заворачивают в черную бумагу и экспонируют при 4;°С 10—45 сут (зависит от качества эмульсии).
