Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Вахтин Ю.Б. -> "Методы культивирования клеток" -> 59

Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.

Вахтин Ю.Б., Соминина А.А. Методы культивирования клеток — Л.: Наука, 1988. — 313 c.
Скачать (прямая ссылка): metodikultivirovaniya1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 53 54 55 56 57 58 < 59 > 60 61 62 63 64 65 .. 171 >> Следующая

Обычная процедура приготовления препаратов для электронно-микроскопического исследования в ультратонких срезах по стандартной методике занимает до 4 сут. Однако рядом исследователей было показано, что это время может быть сокращено до 2—5 ч без значительного ухудшения сохранности ультраструктурных деталей клеток [37]. С незначительными модификациями, применяемыми нами, обработка включает следующие этапы: 1) фиксация охлажденным 2.5 %-ным раствором глутарового альдегида на 0.01 М Ыа-какодилатном или фосфатном буфере, pH 7.2—7.4—15 мин (если клетки обрабатываются в монослое, то их достаточно сполоснуть одним из этих буферов перед осмиевой фиксацией; суспензионные культуры, обрабатываемые в осадке, промывают 2—3 раза по 2 мин); 2) фиксация в течение 45 мин оптимальным по нашим данным хром-осмиевым фиксатором по Дальтону [38], что позволяет одинаково сохранить субклеточные структуры как эукариотических клеток, так и различных микроорганизмов (состав фиксатора: 4 %-ный раствор бихромата калия, pH 7.2, доводится 2.5 н. КОН; одну часть этого раствора смешивают с одной частью 3.4 %-ного раствора NaCl, к этой смеси прибавляют 2 %-ный раствор четырех -окиси осмия в соотношении 1:1); 3) обезвоживание в восходящих концентрациях этанола (50—100 %) по 5—6 мин; 4) промывание 100 %-ным ацетоном (3 раза по 5 мин); 5) пропитка в смеси 100 %-ного ацетона и эпоксидной смолы (1:1) — 15—20 мин; 6) заливка в чистую смолу с однократной заменой через 10—15 мин;
7) полимеризация при 95 °С в течение 1 —1.5 ч.
Таким образом, на всю процедуру уходит около 4—4.5 ч. Полученный полимер с осадком, заключенным в капсулу, готов к резке и в тот же день может быть исследован в электронном микроскопе.
Плоскопараллельный полимер с монослоем может быть либо расчленен на фрагменты, зажат в плоский держатель и порезан поперечно, либо выбранные участки монтируются на блок-держатель с помощью той же смолы и полимеризуются еще 1 ч при 95 °С (или ночь при 65 °С). В дальнейшем с блока готовят ультратонкие срезы, которые после окрашивания могут быть исследованы в электронном микроскопе.
В этом варианте обработки возможны все же некоторые арте-
Ш
факты — микроразрывы, частичное склеивание хроматина и тонкого фибриллярного компонента. Однако главные структурные элементы клеток и вирусы сохраняются удовлетворительно и препарат может <Сыть проанализирован (подрббмее см. [39—43]).
Методы выявления микоплазм в культурах клеток
Из 88 видов микоплазм, известных к настоящему времени, клетки млекопитающих и человека, культивируемые in vitro, спонтанно контаминируют главным образом 7 видов микоплазм: Mycoplasma orale, М. salivarium, М. hominis, М. hyorhinis, Acholeplasma laidlawii,
, Mycoplasma arginini, M. fermentans. Авторы, проводившие соответствующие обследования на базе нескольких крупных исследовательских центров Европы и Америки, отмечают, чтоив разное время и в разных лабораториях обычно преобладают 2—Зиз перечисленных видов [18].
Назовем основныешетоды обнаружения микоплазм: микробиологический, электронно-микроскопический, использование индикаторных клеточных линий с последующим их анализом, окраска флюорохрома ми, авторадиография, иммунофлюоресценция, биохимические методы, ДНК—гДНК-гибридизация.
Микробиологический контроль. Некоторые виды микоплазм-тчКФмта ми мантов клеточных культур (A. laidlawii, М. salivarium) хорошо растут на искусственных питательных средах. iB этих случаях микробиологический метод является эффективным для обнаружения контаминации. Для^ыделения микоплазм рекомендуется использовать среду следующего состава: 0.3 %-ный агар, \приготовленный на ферментативном (трипсин) переваре сердечной мышцы — 7 частей, 25 %-ный дрожжевой экстракт — 1 часть, нативная лошадиная сыворотка — 2 части, причем сыворотка обязательно должна быть предварительно проверена на отсутствие возможной микоплазменной «¦бактериальной контаминации. Культуральная среда (1 мл) от 4—5-суточных культур с образовавшимся монослоем и надосадочная жидкость от однократно замороженных и затем оттаявших клеток, осветленная при 800 об/мин, высевается уколом в пробирки с питательной средой (10 мл), посевы культивируют при 37 °С в течение
2 нед, результаты учитывают еженедельно. Микоплазмы вырастают в толще агара в виде мелких единичных светлых колоний при невысокой степени контаминации или в виде легкого облачка при значительной контаминации.
При микроскопическом исследовании колонии (увеличение ^Xil-350), извлеченной из толщи агара, видны полиморфные структуры: гранулы, нити, шары различной оптической плотности. На поверхности 1.3 %-иой агаровой среды колонии микоплазм часто имеют вид яичницы-глазуньи.
При отсутствии роста рекомендуется провести 3 слепых пассажа. Отсутствие роста в пассажах свидетельствует либо о чистоте культуры, либо о контаминации клеток трудно культивируемыми штаммами микоплазм. Для выделения таких штаммов следует внести
в среду L-аргинин (до конечной концентрации 2 %), глюкозу (1 %), пептон (2 %), комплекс.витаминов для среды Игла и дифосфопири-диннуклеотид (O.QQ2'%>).
Предыдущая << 1 .. 53 54 55 56 57 58 < 59 > 60 61 62 63 64 65 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed