Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Возбуждение флюоресценции осуществляется через фильтр УФС-6 (5—8 мм), поляризатор помещают между полевой диафрагмой и светоделитель ной пластинкой опак-иллюминатора. Используют объектив водной иммерсии 60x1.0 Флюоресценция регистрируется с участка поля зрения диаметром 3 мкм. Обычно осуществляется сканирование выбранной зоны препарата вдоль определенной линии длиной 150—200 мкм. Для уменьшения ошибок, связанных с фотовыцветанием, с помощью полевой диафрагмы микроскопа ограничивают область препарата, освещаемую возбуждающими лучами. При необходимости размеры полевой диафрагмы и фотометрического зонда увеличивают.
Степень поляризации (Р) на основании данных измерения вычисляется, по формуле
n_ (Il —h<i> ~ (lл. —l±.ь) \
(I i — Л|ф) + V ± — l _1_ф) где /цфи /Хф— интенсивности сигнала с участков фона соответственно при параллельном в взаимоперпендикулярном расположении анализатора.
На рис. 2, д и е (см. вклейку) представлена микрофотография интактных клеток ЗТЗ в свете флюоресценции ДФГТ. Общая флюоресценция клеток, обработанных ДФГТ, складывается из трех основных компонент: 1) флюоресценции липидных включений
сферической формы, размеры и число которых широко варьируют;
2) диффузной флюоресценции околоядерной зоны клетки; 3) флюоресценции периферической (ламеллярной) зоны клетки. Вклад в общее свечение клетки липидных включений весьма существен и в ряде случаев является определяющим.
Таким образом, применение флюоресцентной микроскопии позволяет получить данные о текучести клеточных мембран в различных компартментах интактной клетки.
Литература
1. Hillman G., Schlessinger J. The lateral diffusion of EQF complexed to its surface receptors does not account for then thermal sensitivity of patch formation and endocytosis // Biochemistry. 1982. Vol. 24. P. 1667—1671.
2. Розанов Ю. М., Соркин А. Д., Сорокин А. Б. Исследование динамических свойств мембран одиночных интактиых клеток ЗТЗ методом поляризационной флюоресценции // Биол. мембраны. 1986. Т. 3. С. 829—837.
3. Tanasugarn L., McNeil P., Reynolds G. Т., Taylor D. L. Microspectrofluoro-metry by digital image processing: measurement of cytoplasmic pH // J. Cell Biol. 1984. Vol. 98. P. 717—724.
4. Rogers J., Hesketh T. R., Smith G. A. et al. Intracellular pH and free calcium changes in single cells using quene 1 and quin 2 probes and fluorescence microscopy // FEBS Lett. 1983. Vol. 161. P. 21—27.
5. Taylor D. L., Amato P. A., Luby-Phelps K-, McNeil P. Fluorescent analog cytochemistry // Trends Biochem. Sci. 1984. Vol. 14. P. 88—91.
6. Haigler H. T. Receptor-mediated endocytosis of epidermal growth factor Д/ Meth Enzymol. 1983. Vol. 98. P. 283—289.
7. Rees A. R., Gregoriou М., Hohnson P., Garland P. B. High affinity epidermal growth factor on the surface of A431 cells have restricted lateral diffusion // EMBO J. 1984. Vol. 3. P. 1843—1847.
8. Sch.ech.ter J., Hernaez L., Schlessinger J., Cautrecasas P. Local aggregation of hormone receptor complexes in required for activation by epidermal growth factor // Nature. 1978. Vol. 278. P. 835—838.
9. Via D. P., Willingham М. C., Pastan I. et al. Co-clustering arid internalization of low-density lipoproteins and a2-macroglobulin in human skin fibroblasts // Exp. Cell Res. 1982. Vol. 141. P. 15—22.
10. Cheng S. Y., Maxfield F. R., Robbins J. et al. Receptor-mediated uptake of 3,3',5-triiodo-L-thyronine by cultured fibroblasts // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.
1980. Vol. 77. P. 3425—3429.
11. Geisow М. I. Fluorescein conjugates as indicators of subcellular pH. A critical evalution // Exp. Cell Res. 1984. Vol. 150. P. 29—35.
12. Willingham М. C., Pastan I. The visualization of fluorescent proteins in li, ving cells by video intensification microscopy // Cell. 1978. Vol. 13. P. 501 — 507.
13. Willingham М. C., Pastan I. Image intensification techniques for detection of protein in cultured cells // Meth. Enzymol. 1983. Vol. 98. P. 266—282.
14. Maxfield F. R., Schlessinger J., Schechter Y. et al. Collection of insulin, EQF and аг-macroglobulin in the same patches on the surface of cultured fibroblasts and common internalization // Cell. 1978. Vol. 14. P. 805—810.
15. Соркин А. Д., Тесленко Jl. В., Никольский И. Н., Трошин А. С. Общий путь эндоцитоза эпидермального фактора роста и трансферрина в ассоциированный с комплексом Гольджи, закисленный (pH 6.1) компартмент клеток А431 // Докл. АН СССР. 1986. Т. 289. С. 212—215.
16. Tycko В., Maxfield F. R. Rapid acidification of endocytic vesicles containing a2-macroglobulin // Cell. 1982. Vol. 28. P. 643—651.
17. Соркин А. Д., Богданова И. П., Никольский Н. Н., Сорокин А. Б. Влияние аминов на pH в лизосомах клеток ЗТЗ // Цитология. 1985. Т/27. С. 203—208.
18. Тесленко Л. В., Звонарев О. Ф., Плахов С. А. и др. Рецептор-опосредованный эндоцитоз аг-макроглобулина: исследование на живых клетках ЗТЗ // Цитология. 1986. Т. 2. С. 1097—1102.
19. Розанов Ю. М., Барский И. Я., Боровиков Ю. С. Двухканальный микрофлюори-метр // Цитология. 1970. Т. 12. С. 1477—1480.
