Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Суспензия с клетками подается в капилляр с помощью микронасоса, автоматизированного шприца или каким-либо другим способом. Избыточное давление в камере около 0.5 атм. С выхода фотоэлектронного умножителя импульсы сигнала поступают на усилитель (БУС-2-97) и далее в многоканальный амплитудный анализатор (АИ-1024). Для контроля скорости анализа используется частотомер. Информация в форме гистограмм выводится на графопостроитель (Н-306) и цифропечатающее устройство (УВЦ2-95).
Среди промышленных моделей проточных цитометров-анализа-торов следует отметить модель ICP-22 фирмы «Ortho Instruments» (США), а также Parthograph фирмы «KRATEL» (ФРГ); в последней модели обеспечено стандартизированное определение размеров клеток.
Исследуемые характеристики клеток
На измерении параметров флюоресценции и светорассеяния в проточных цитометрах основан анализ самых различных характеристик клеток и их фрагментов: содержания основных клеточных компонентов и антигенов клеточной поверхности, активности некоторых ферментов, размеров клеток и др. Наиболее широко ПЦМ используется в исследованиях ДНК (около 75—80 % всех исследований методом ПЦМ).
ДНК. Для количественного определения содержания ДНК имеется довольно много флюорохромов, различающихся спектральными характеристиками и механизмами связывания с ДНК. Характеристики наиболее употребляемых из них приведены в таблице.
Цитометрия ДНК проводится на обработанных детергентом или фиксированных клетках, так как практически все красители, пригодные для этой цели, не проходят через мембрану живой клетки. Заметной проницаемостью обладает лишь Хёхст 33342, что позволяет использовать его для анализа содержания ДНК в живых клетках и сортировки их по этому параметру [2]. Среди методик, приведенных в таблице, для практического применения следует рекомендовать ту, в которой используется комбинация красителей оливомицина (или митрамицин, или хромомицин) и бромистого этидия. Ее достоинствами являются высокая надежность и воспроизводимость окраски, значительная яркость флюоресценции при использовании ртутных ламп в качестве источников возбуждения, доступность реактивов (пропись № 1).
Рис. 1. Блок-схема одиокаиальиого проточного цитометра на базе микроскопа Л ЮМАМ-И.
/—иакоиечннк форсунки проточной камеры; 2—капилляр проточной камеры; 3—корпус форсунки; 4 — резиновое кольцо; 5 — прижимная шайба; 6 — трубка для подачи несущей жидкости; 7 — покровное стекло; 8 — полоска для сбора жидкости; 9 — микрообъектив микроскопа; 10— светоделительиая пластинка опак-нллюмииатора микроскопа; 11—источник света ДРШ-250-2; 12—коллектор осветителя микроскопа; 13 — теплозащитная кювета; 14 — светофильтр для выделения возбуждающего света; 15 — линза; 16 — апертурная диафрагма; 17 — лниза; 18 — полевая диафрагма; 19 — светофильтр для выделения света флюоресценции; 20 — призма; 21 — окуляр; 22— диафрагма в плоскости изображения микроскопа; 23 — фотоэлектронный умножитель.
Краситель Класс Цвет флюоресценции Литературный
источник
Бромистый этидий Интеркалятор Кирпично-красный [35]
йодистый пропидий » 36, 37]
Оливомицин Г---Ц-связывание Зелено-желтый 35, 38]
Митромицин » » 35, 38]
Хромомицин [35, 38, 39]
Хёхст 33258 (Bisben- А---Т-связывание Г олубой [35, 401
simide Н 33258 Fluo-
roclirome)
DAP1 (4,6-диамидино- » » [35, 41]
2-фенилиидол)
Акрифлавин Реакция Фельгена Зеленый [42]
Оливомицин + броми Г---Ц-связыва- Кирпично-красный [43]
стый этидий иие+интеркалятор
Синтез ДНК методом ПЦМ исследуется с помощью 5-бром-дезоксиуридина (БДУ), аналога тимидина. БДУ, включенный в ДНК, тестируют либо иммунофлюоресцентным методом, либо по эффекту тушения им флюоресценции некоторых красителей. Первый метод гораздо чувствительнее, позволяет использовать менее токсичные концентрации БДУ и уменьшать период мечения примерно до 20 мин [3]. Второй метод доступнее на практике. Чаще всего в этом случае используют Хёхст 33258, который очень эффективно тушится бромдезоксиуридином (пропись № 2).
РНК. Исследование содержания РНК в клетке может быть проведенб'с помощью акридинового оранжевого (АО) после селективной денатурации двуспиральной РНК- Используются несколько способов соответствующей цитохимической обработки клеток [4, 5]. При этом на однонитчатой денатурированной РНК АО образует димеры, которые в отличие от мономерной формы красителя флюоресцируют в красной области спектра. Мономеры АО интеркалируют в неповрежденную биспиральную ДНК, и по интенсивности их зеленой флюоресценции можно оценивать содержание ДНК. Таким образом, это по существу метод двойного окрашивания и измерения содержания РНК—ДНК. по красно-зеленой флюоресценции АО. Применяется также способ определения содержания РНК с помощью пиронина Y [6, 7].
