Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Другим важнейшим моментом является высокоэффективная регистрация флюоресцентного сигнала. Возможные комбинации «запирающих» светофильтров также представлены в таблице. Отметим, что в любом случае (если имеется возможность) лучше идти по пути не повышения, а снижения интенсивности возбуждающего света, чем достигается уменьшение выгорания флюорохромов и увеличение коэффициента пропускания фильтров регистрации и чувствительности приборов, регистрирующих люминесцентное изображение клетки. В качестве регистрирующих приборов используются или фотокамера, или телекамера (видикон), или фотоэлектронные умножители (ФЭУ). Обычно для регистрации свечения
Номера комбинаций фильтров для возбуждения и регистрации флюоресценции флюоресцеина (1—12) и родамина (13—17)
, Фильтры возбуждения Светоделительиые пластинки и запирающие фильтры
Зл Зл-2 Зл-З Зл-З и Зл-З и Кр Кр (без КС11)
СЗС-21-2 И-520 и ОС 14*4
СС-15-6, ЖС-11-2 _ 1 2 _ _ _ _
И-450, СС-15-2, ЖС-11-2 3 4 5 6 7 --- ---
И-475, СС-5-2 . 8 9 10 11 --- --- ---
И-490, СС-5-2, ЖС-16-4 --- --- , --- --- 12 --- : ---
СЗС-22-2, ПС-7-2, ОС-11-4, --- --- --- --- --- 13 ! ---
СЗС-21-2
СЗС-22-6, СЗС-21-2 --- --- --- --- --- 14 1 15
И-546, СЗС-22-2, СЗС-21-2 --- --- --- --- --- 16 17
Примечание. Зл, Зл-2, Зл-З — зеленые светоделительиые пластинки со стандартной склейкой ЖС18 и ЖЗС19; Кр — красная светоделительиая пластиика со стандартным «запирающим* фильтром КС11; И-520— интерференционный фильтр с максимумом пропускания 520 им. Назначение фильтров для флюоресцеина1. 1 и 2 — максимальная яркость, сравнительно высокие фои и автофлюоресцеиция клеток; 3—5 — минимальный фои, используется для микрофотографирования; 6 и 11 — минимальная собственная люминесценция клеток, применяется для метода двойной люминесценции; 7 и 12 — для измерения pH; 8—10 — минимальный фон. минимальная собственная люминесценция клеток. Назначение фильтров для родамина: 13 и 16 — выделяется линия свечения лампы с длиной волны 546 им для возбуждения флюоресценции тетраметилродамииа, используется для метода двойной люминесцентной метки; 14—максимальная яркость, возбуждает кроме родамина и флюоресиеии, высокая собственная люминесценция клеток; 15 — максимальная яркость, максимальное пропускание флюоресценции родамина, кроме родамина возбуждается и флюоресцеин, высокая собственная люминесценция клеток; 17— высокая яркость, минимальная собственная люминесценция клеток, флюоресиеии не возбуждается, фои низкий.
флюоресцеина применяется пленка РФ-3, для родамина — пленки «Изопанхром» тип 22 или 17 и А-2. Для микрофотометрирования применяются стандартные ФМЭЛ-1 и 1а, различные самодельные насадки с ФЭУ или входящая в состав микроскопа ЛЮМАМ-ИУФ насадка для фотометрии. В состав ФМЭЛ или ЛЮМАМ-ИУФ входят различные запирающие интерференционные фильтры. Необходимость применения высокочувствительных видиконов (супервидиконов) с кремниевой мишенью объясняется тем, что чувствительности пленки не хватает, чтобы быстро сфотографировать несколько раз живую клетку. В частности, можно использовать отечественный супервидикон ЛИ-702, который устанавливается в лабораторный макет промышленной телевизионной камеры, работающей в стандартном режиме разложения. Камера сочленяется с тубусом стандартной фотонасадки микроскопа, в которой находится окуляр (гамаль, Х1.7). Для максимального использования чувствительности трубки в камере отключают схемы обратной связи по ускоряющему электроду, что позволяет использовать супервидикон в высокочувствительном режиме работы. В качестве монитора может служить телевизор «Электроника-432». Фотографирование производят с экрана монитора на пленку РФ-3.
Для анализа и запоминания видеосигнала можно применять видеомагнитофон или анализатор изображения. В настоящее время проводятся испытания возможностей отечественного цветного анализатора ПЛОТ-Г.
: Рис.. 1 > Схема комплексной установки для прижизненной люминесцентной микроскопии клеток.
/ — объект; 2 — микроскоп ЛЮМАМ; 3 — фотонасадка; 4 — телекамера на базе супервиди-кона ЛИ-702; 5 — монитор; 6 — устройство памяти и анализа; 7 — фотокамера; 8 — ФМЭЛ¦ IА; У — усилитель; 10 — самописец; 11 — фотокамера для съемки с экраиа монитора.
Общая схема комплексной установки на базе микроскопа ЛЮМАМ для прижизненной микроскопии клеток представлена на рис. 1. Подобные комплексы, создаваемые на базе инвертированных микроскопов, описаны в ряде работ [12, 13].
Возможности метода
С помощью люминесцентной микроскопии можно решать ряд задач, сохраняя клетки живыми и прикрепленными к субстрату.
Наименее 'сложной проблемой является наблюдение и микрофотографирование процесса эндоцитоза флюоресцентно меченного лиганда. Если необходимо получить несколько фотографий ранних стадий эндоцитоза, то предпочтительнее использовать видеомикроскоп, сокращая время и интенсивность засветки до минимума. Сильный свет ведет к выгоранию красителя и нарушает внутриклеточное движение эндосом с лигандом [13]. Инкубация с одновременным наблюдением ведется при температуре 37 °С с клетками, предварительно инкубированными с меченым лигандом и затем отмытыми от него. Ранние стадии эндоцитоза — кластеризацию , лиганд-рецепторных комплексов и образование мелких эндосом — практически невозможно наблюдать при использовании техники, описанной в-этой работе. Поэтому первой видимой картинкой после
