Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
ЦТ
начала эндоцитоза является стадия образования крупных эндосом и мультивезикулярных тел. Эта стадия легко идентифицируется при исследовании поступления ЭФР-родамина в клетки А431 и а2-макроглобулина, меченного и флюоресцеином, и родамином, в клетки ЗТЗ, NRK и фибробласты человека. Пример фотографии клеток, инкубированных с а2-макроглобулином, полученной с экрана монитора, представлен на рис. 2, а (см. вклейку). С помощью видеосистемы можно получить до 20 аналогичных фотографий одной клетки без применения устройства памяти в течение нескольких минут. Стадия аккумуляции лигандов, например ЭФР-Р, в районе комплекса Гольджи легко регистрируется с помощью микрофотографирования на пленку, чувствительную к свечению родамина (рис. 2, б, см. вклейку).
Несколько более сложным представляется метод двойной флюоресцентной метки [14, 15]. Клетки инкубируются с двумя различными лигандами, один из которых конъюгирован с родамином, а другой с флюоресцеином. Затем на определенной стадии эндоцитоза делаются две фотографии одного и того же участка монослоя клеток в свете люминесценции флюоресцеина (набор фильтров № 6) и родамина (набор фильтров № 13 или № 16). Контролем селективности фильтров является отсутствие красного свечения при возбуждении зеленой люминесценции в аналогичных препаратах клеток, инкубированных только с лигандом, меченным флюоресцен-ном.
Важной характеристикой компартментов, участвующих в эндо-цитозе, является величина их внутреннего pH. Измерить эту величину можно только в живой клетке с помощью конъюгированных с флюоресцеином лигандов, поступающих в данные компартменты. Спектр флюоресценции флюоресцеина сильно зависит от pH микроокружения в интервале от 4 до 7. Его свечение, регистрируемое в канале с длиной волны 520 нм при возбуждении светом с длиной волны 490 нм, возрастает в несколько раз при. изменении pH от
4 до 7, тогда как свечение при возбуждении светом длиной волны 450 нм возрастает незначительно. Таким образом, с помощью количественной микрофотометрии живых клеток можно оценить величину pH в любой точке клетки, где локализован флюоресцеии, по отношению интенсивности флюоресценции, регистрируемой с помощью наборов фильтров № 7 и № 12 (или № 18). Микро-флюорометрический метод измерения pH в клеточных компартментах пока используется группой американских авторов [16] ив нашей лаборатории [15, 17].
Низкая величина pH в лизосомах и эндосомах (около 5—6) обусловливает слабое свечение флюоресцеина, находящегося в данных органеллах. При повышении pH, например, при внесения в клеточную среду метиламина, хлорохина или ионофора моненсина, возрастает не только общая интенсивность сигнала при возбуждении светом длиной волны 490 нм, но и резко улучшается качество изображения клетки. Поэтому если лиганд находится в кислом микроокружении, то это легко установить и визуально, сравнивая фотографии
133
I
клетки до и после снятия градиента pH аминами или моненсином. На; рис. 2, в и г (см. вклейку) приведены две фотографии одной й' той же клетки А431, инкубированной с ФИТЦ-декстраном — маркером лизосом, до и после действия 0.02 М метиламина. Когда изображения клетки получены при возбуждении светом длиной волны 490 нм, то во втором случае (рис. 2, г) клетка светится значительно ярче. При возбуждении флюоресценции светом длиной волны 450 нм изображения клетки до и после действия метиламина практически неотличимы. Аналогичный метод приближенной оценки закисления органелл был применен для определения степени закисленности эндосом клеток ЗТЗ, содержащих а2-макроглобулин-флюоресцеин [18].
Примером другой задачи, решаемой методом флюоресцентной микроскопии, может служить определение текучести клеточных мембран по поляризации флюоресцентных «липидных» зондов, таких как 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен (ДФГТ). Покровные стекла с культурами различной плотности инкубируют в С02!-инкубаторе в течение 20 мин с 3 • 10~6 М раствором ДФГТ в кондиционированной сывороточной среде при 37 °С. Затем среду с ДФГТ сливают и в чашку добавляют 4 мл свежей среды Игла с 0.02 М HEPES (pH 7.2, 24 °С).
Используемые соотношения концентрации ДФГТ в среде, ее объема и количества клеток в системе не приводили к серьезным изменениям в структуре и функционировании мембран клеток. Ростовые характеристики культуры клеток ЗТЗ не менянотся в присутствии ДФГТ по крайней мере в течение недели. Концентрационной деполяризации флюоресценции зонда (ДФГТ), связавшегося с клеточной мембраной, не наблюдается.
Чашки с покровными стеклами помещают на предметный столик поляризационного микроскопа-флюориметра, собранного на основе ЛЮМАМ-ИУФ1. Камеру с фотоумножителем заменяют на фотометрическую насадку с поляризационной призмой-анализатором и двумя ФЭУ, как это описано ранее [19]. Сигналы с ФЭУ после усиления подаются на разные каналы накопителя Ф-36. Таким образом, интенсивность двух составляющих поляфизованного излучения, /и и /^регистрируется в памяти Ф-36 одновременно.
