Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Вахтин Ю.Б. -> "Методы культивирования клеток" -> 76

Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.

Вахтин Ю.Б., Соминина А.А. Методы культивирования клеток — Л.: Наука, 1988. — 313 c.
Скачать (прямая ссылка): metodikultivirovaniya1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 70 71 72 73 74 75 < 76 > 77 78 79 80 81 82 .. 171 >> Следующая

Если нет специальных требований, суспензию для окрашивания и анализа приготавливают на сбалансированном буферном солевом растворе (например, на фосфатно-солевом буфере Дальбекко без кальция и магния, на растворе версена или растворе Хэнкса). При изучении внутриклеточных компонентов используют фиксированные клетки или проводят обработку клеток детергентом, чаще всего 0.05—0.2 %-ным (в зависимости от типа клеток) раствором Тритона Х-100. В качестве фиксатора в большинстве случаев используют 70—80 %-ный этанол. Фиксируют, приливая к суспензии охлажденный 95 %-ный этанол. Перед окрашиванием клетки отмывают от фиксатора. В ряде случаев (например, при проведении цитометрии ДНК, РНК, белка) допускается отмытые от среды
Рис. 2. ДНК-гистограммы — распределение клеток по содержанию ДНК. а — гистограмма без помех; б — гистограмма с помехами. / — поврежденные клетки; 2 — шум; Л| и nj — номер канала. По оси абсцисс — содержание ДНК; по оси ординат — число клеток.
с сывороткой клетки окрашивать и анализировать непосредственно в 25—30 %-ном этаноле на сбалансированном буфером солевом растворе.
Приготовленная для анализа суспензия не должна содержать больших комков и других частиц, которые могут засорить проточную камеру. Слипшиеся клетки и осколки клеток ухудшают качество гистограммы и затрудняют анализ. Поэтому часто требуется очистка суспензии фильтрацией через металлическую сеточку с ячейками до 100X100 мкм или через несколько слоев нейлоновой ткани, а также дезагрегация комков из нескольких клеток. При работах на цитометрах-анализаторах с диаметром выходного отверстия форсунки проточной камеры 100—150 мкм и более достаточно бывает визуального контроля суспензии и осторожной разбивки агрегатов с помощью шприца с тонкой иглой.
}
Прописи методик ПЦМ-аиализа ,
Пропись № 1. Анализ содержания ДНК. К 0.8 мл клеточной! суспензии на растворе версена (растворе Хэнкса, среде без сыво-; ротки) добавить последовательно 0.1 мл 1 %-ного Тритона Х-100, 0.02 мл бромистого этидия (1 мг/мл), 0.04 мл оливомицина (1 мг/мл), 0.05 мл 0.3 М MgCh- Окрашивать 30—60 мин при комнатной температуре, в холодильнике — более 1 ч, оптимально — 4—5 ч. При окраске в холодильнике проба сохраняется до 2 сут. Если необходим более оперативный анализ (в течение 5—10 мин), целесообразнее использовать методы окраски с помощью Хёхст 33258 или DAPI.
Сохранность маточных водных растворов красителей в холодильнике составляет для оливомицина 2—3 мес, для бромистого этидия — до 6 мес.
Пропись № 2. Анализ синтеза ДНК. Приготавливается раствор Хёхст 33258 в концентрации 10 мкг/мл на сбалансированном буфером солевом растворе с 25 % этанола. Клетки, инкубированные в среде
с БДУ, собираются и после центрифугирования (400 g, 10 мин) ресуспензируются в растворе красителя. Концентрация БДУ в среде, необходимая для полного тушения флюоресценции Хёхст 33258, зависит от партии используемой сыворотки и типа клеток. Она может составлять до 10 мкг/мл и более, обычно 2—3 мкг/мл.
Пропись № 3. Определение доли живых и мертвых клеток. Приготавливаются маточный раствор ФДА или с-ФДА в ацетоне (10 мг/мл) и маточный раствор бромистого этидия в дистиллированной воде (1 мг/мл). Для получения рабочего раствора ФДА 20 мкл маточного раствора добавляют к 5 мл сбалансированного буфером солевого раствора. Клеточный осадок после центрифугирования (около 1.5 • 106 клеток) инкубируется в 0.5 мл раствора ФДА 15 мин при 37 °С. Клетки отмываются в сбалансированном буфером солевом растворе и,ресуспензируются в 1 мл этого раствора. В суспензию с клетками добавляется 10 мкл маточного раствора бромистого этидия. Анализ проводится через 5—10 мин.
Пропись № 4. Анализ содержания ДНК—общий белок. К 0.2 мл фиксированной в 70—80 %-ном этаноле клеточной суспензии, содержащей 5* 106 клеток, добавляется 4 мл раствора версена. Приготавливается непосредственно перед использованием раствор ФИТЦ (1 мкг/мл): ФИТЦ растворяется в абсолютном этаноле и
0.1 мл этого раствора добавляется к 10 мл раствора версена; 0.2 мл раствора ФИТЦ на растворе версена добавляется к клеточной суспензии. Через 5 мин 1 мл раствора бромистого этидия (46 мкг/мл) также добавляется к клеточной суспензии. Через 2—3 мин добавляется 0.2 мл раствора РНКазы (1 мг/мл на растворе версена) при комнатной.температуре. Конечная концентрация бромистого этидия, ФИТЦ и РНКазы — 8.5, 0.37 и 37 мкг/мл соответственно. Анализ — через 5 мин после добавления РНКазы.
Пропись № 5. Анализ содержания ДНК—РНК [4, 5]. К 0.2 мл клеточной суспензии (2 • 105 клеток) прибавляется 0.5 мл раствора, содержащего 0.1 % (объем/объем) Тритона Х-100, 0.2 М сахарозы и 10“4М ЕДТА в цитратно-фосфатном буфере (pH 3). Через 1 мин прибавляется 1 мл раствора, содержащего 0.002 % акридинового оранжевого (20 мкг/мл) ,и 0.1 М NaCl в цитратно-фосфатном буфере (pH 3.8). Время окрашивания 5 мин при комнатной температуре. Анализ — сразу после окрашивания.
Предыдущая << 1 .. 70 71 72 73 74 75 < 76 > 77 78 79 80 81 82 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed