Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Проточная цитометрия
Ю. М. Розанов
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Проточная цитометрия (ПЦМ) — скоростной метод анализа отдельных клеток и клеточных структурных компонентов в потоке жидкости. Производительность анализа составляет 1000 клеток в 1 с и более, и это является главной технологической характеристикой метода. Другой уникальной особенностью ПЦМ является возможность сортировки клеток непосредственно сразу после измерения и, таким образом, получения для дальнейшего морфологического, биохимического или биотехнологического исследования фракций клеток, обладающих определенным значением измеряемого параметра. Техника ПЦМ — это главным образом техника флюоресцентных измерений с применением многочисленных зондов-красителей. Практически любой цитохимический прием, использующийся в флюоресцентной микроскопии для окраски клеток, может служить основой для проведения анализа методом ПЦМ.
Принцип метода и приборы
В проточных цитометрах исследуемые клетки или клеточные фрагменты, находящиеся в суспензии, тем или иным способом вводятся в центр узкого ламинарного потока несущей жидкости. Благодаря тому что расход несущей жидкости устанавливается значительно большим, чем расход суспензии с клетками, в сформированном потоке клетки идут одна за другой, в среднем на очень большом по сравнению с их размерами расстоянии. Скорость потока 5—10 м/с, его диаметр обычно составляет 50—150 мкм. Отрезок пути, где происходит измерение, отдельная клетка проходит за время от 1—2 до 30—50 мкс в зависимости от конструкции прибора. Импульсы соответствующей длительности образуются на выходе датчика (или датчиков, если измеряется несколько параметров
одной клетки) оптического излучения и поступают в электронную систему для анализа. В результате происходит накопление информации в форме «величина параметра—число клеток».
Проточные цитометры подразделяются на цитометры-анализа-торы, обеспечивающие лишь анализ параметров без сортировки клеток, и цитометры-сортировщики, выполняющие, кроме аналитических, препаративные функции. В качестве источников оптического излучения в сортировщиках, как правило, применяются лазеры. Это в значительной степени определяет конструкцию приборов. Лазерный луч пересекает струю с клетками в воздухе после выхода ее из капилляра проточной камеры и перед тем, как она разбивается на отдельные капли, содержащие клетки. В момент отрыва от струи капли заряжаются и далее в электрическом поле происходит их разделение. Наиболее широко используются модели цитометров-сортлровщиков EPICS фирмы «Coulter Electronics» (Франция) и FACS фирмы «Beckton-Dickinson» (США).
Цитометры-анализаторы проще и разнообразнее по конструкции. В качестве источника света в них используются преимущественно ртутные газоразрядные лампы. Такие приборы, как правило, уступают цитометрам-сортировщикам на лазерах в предельной чувствительности, но превосходят их в точности измерения, в разрешающей способности при выявлении небольших изменений исследуемых параметров и, конечно, в простоте обращения с ними и доступности. В лабораторной практике наиболее простой путь разрешения трудностей при создании цитометров-анализаторов — использование люминесцентных микроскопов. Блок-схема одного из таких приборов, одноканального проточного цитометра на базе микроскопа фирмы ЛОМО ЛЮМАМ-Й, приведена на рис. 1. В приборе использована проточная камера, легко изготавливаемая в лабораторных условиях (описание аналогичной установки см. [1]). В этой камере струя с клетками, сформированная наконечником /, падает под углом на нижнюю поверхность покровного стекла 7, проходит по этой поверхности 3—4 мм и самотеком убирается с помощью полоски какого-либо смачивающегося материала 8. Камера устанавливается на предметном столике микроскопа и юстируется так, чтобы проходящие клетки, наблюдаемые как светящийся шнур, оказались в поле зрения микрообъектива 9. Основными деталями камеры, кроме наконечника /, являются металлический капилляр 2, вклеенный в корпус 3, и резиновое кольцо 4, которое плотно удерживает наконечник и служит прокладкой между корпусом и прижимной крышкой 5. Наконечник изготавливается из стеклянной трубки, например пипетки, вытягиванием над газовой горелкой. Торец наконечника после откалывания можно не шлифовать. Под микроскопом контролируют получившийся диаметр выходного отверстия наконечника и отбирают требуемый в пределах 100— 150 мкм. Диаметр стеклянной трубки обычно выбирается равным 5—6 мм, толщина стенок 1 —1.5 мм, общая длина наконечника 30—40 мм. Металлический капилляр изготавливают из тонкой шприцевой иглы, которая обрезается и округляется с обоих концов.
11 12 13
I
14 15 16
i
П
Усилитель
' БУС-2-97
Частотомер
4ь
22
Блок
питания
ФЭУ
