Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Частоту обнаружения устойчивых вариантов можно определить по формуле F=C/EN, где F—частота обнаружения устойчивых вариантов, С — общее число клонов устойчивых клеток, Е — эффективность клонирования тестируемых клеток, выраженная в долях единицы, N — число посеянных клеток.
Обработка клеток мутагенами. При обработке клеток мутагенами и последующем посеве для отбора следует помнить, что три параметра существенно влияют на частоту обнаружения устойчивых вариантов: 1) доза мутагена (концентрацияхвремя), 2) плотность посева (для обработки мутагеном и для посева на селекцию) и 3) время проявления исследуемого признака после обработки мутагеном (концентрация селективного агента уже выбрана и является постоянной величиной).
1. Доза мутагена. Так как наблюдается хорошая корреляция между мутагенной и токсической концентрацией химического соеди-
нения, то дозу мутагена можно подобрать путем определения эффективности клонирования клеток, обработанных мутагеном в разных концентрациях. Для этого следует, например, в качестве исходного взять 0.01 М мутаген, затем, разводя его, получить ряд градуально уменьшающихся концентраций. Посеять по 200—300 клеток на чашку, после прикрепления клеток добавить мутаген, на каждую концентрацию мутагена должно приходиться по 3 чашки. Клетки инкубировать в присутствии мутагена в течение заданного времени (см. ниже). Выросшие клоны сосчитать и построить кривую выживаемости на основе отношения эффективности клонирования в процентах (логарифмическая шкала) к концентрации мутагена (в М или мкг/мл, линейная шкала). Концентрация мутагена, приводящая к репродуктивной гибели 30—80 % клеток, как показывает анализ литературы, является оптимальной для индукции мутантных вариантов. Время действия мутагена стараются подобрать таким образом, чтобы агент присутствовал в среде на протяжении клеточного цикла. Такие условия подходят для стабильных мутагенов типа этил-метансульфоната (ЭМС). Однако в большинстве случаев из-за нестабильности мутагенов время приходится уменьшать. Бессмысленно обрабатывать клетки метил-нитрозомочевиной 16—18 ч, так как обычно она распадается за 0.5—1 ч. В присутствии сыворотки очень нестабильны такие часто используемые мутагены,как N-метилнитронитрозогуанидин (МННГ) и М-ацетокси-2-ацетиламинофлюорен (2-НОФ) [5]. Поэтому обработку клеток мутагенами проводят, как правило, от 0.5 до 4 ч в бес-сывороточной среде.
2. Плотность посева и способы обработки. Обработку клеток мутагенами можно проводить как в монослое, так и в суспензии. Для этого клетки высевают в стеклянные или пластиковые чашки Петри или во флаконы Карреля, начальная плотность посева (10—
15) • 103 клеток на 1 см2 (клетки следует обрабатывать тогда, когда плотность культуры составляет примерно 1 /з—1 /2 конфлюэнтной, т. е. на стадии логарифмического роста). Через 2 сут после посева среду удаляют, клетки промывают средой без сыворотки и добавляют ее вместе с мутагеном в определенной концентрации.
. При краткосрочных обработках клетки мржно инкубировать с мутагеном в растворе Хэнкса, при более длительных сроках обработки и в тех случаях, когда сыворотка не инактивирует мутаген, клетки обрабатывают мутагеном в среде в присутствии сыворотки. Мутагены, как правило, плохо растворимы в водных растворах, поэтому их сначала растворяют в таких растворителях, как ацетон, этиловый спирт, ДМСО, а затем в фосфатном буфере, растворе Хэнкса или среде без сыворотки. В контрольные чашки Петри вносят такой же объем растворителя, как в чашки, в которых производится обработка мутагеном. Инкубация клеток с мутагеном проводится при 37 °С в обычном термостате или, если клетки посеяны в чашки Петри, в инкубаторе с повышенным содержанием СОг. Время обработки таким мутагеном, как ЭМС, составляет 16—18 ч (200—300 мкг/мл), для МННГ — 3—4 ч (1.5—3 мкг/мл). После обработки мутагеном
среда осторожно удаляется пипеткой, клетки промывают раствором Хэнкса или средой без сыворотки, трипсинизируют и высевают на свежую среду с сывороткой. Часть клеточной суспензии высевают в чашки Петри для определения эффективности клонирования (числа жизнеспособных клеток).
При обработке клеток в суспензии их снимают с подложки смесью растворов трипсина и версена, центрифугированием отделяют от снимающей жидкости и промывают раствором Хенкса или средой без сыворотки. Суспензию клеток или суспензионную культуру помещают в силиконизированный стеклянный сосуд. В среду добавляют; мутаген в определенной концентрации (так как снятые с подложки клетки более чувствительны к повреждающему действию мутагена, его концентрация может быть меньше, чем та, которая использовалась для обработки клеток в монослое, однако в любом случае ' выживаемость клеток после обработки мутагеном является критерием для выбора концентрации мутагена). Клетки помещают в термостат, обработка производится при мягком покачивании или встряхивании суспензии клеток. Такой способ позволяет обработать большое число клеток, не загрязняя при этом мутагеном чашки или флаконы, большие количества клеток особенно нужны в тех случаях, когда определяют время, необходимое для оптимального проявления исследуемого признака.
