Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
3. Выбор времени проявления признака зависит от фиксации индуцированных мутагеном повреждений в ДНК и от периода полужизни белка-фермента. Например, время полужизни ГГФРТ составляет «римерно 24 ч, это означает, что на 7-е сутки количество нормального, немутантного, продукта будет составлять V128 (' / #) от исходного уровня. Обычно тестируют следующие сроки: 1) клетки высевают на селекцию сразу после обработки мутагеном (0 сут), 2) клетки высевают на 3—4-е сутки после обработки мутагеном (раньше этого срока клетки не пересевают),
3) клетки высевают на 7—9-е сутки, в середине этого срока клетки ч пересевают 1—2 раза.
Характеристика полученных вариантов. Способность клеток расти на среде в присутствии токсических концентраций селективного агента не является свидетельством того, что полученные варианты — истинные мутанты. Для этого вновь полученные варианты оценивают по следующим параметрам: 1) частота обнаружения вариантов (она должна быть низкой, 10-4—10_б); 2) стабильность наследования исследуемого признака в неселективных условиях (признак должен стабильно сохраняться в ряду клеточных поколений в отсутствие селективного агента); 3) влияние предварительной обработки мутагенами на частоту обнаружения исследуемых вариантов (мутагены должны повышать частоту обнаружения устойчивых вариантов); 4) частота обнаружения ревертантов; 5) отсутствие или изменение активности фермента в том случае, если селективный агент действовал непосредственно на фермент. Если варианты удовлетворяют всем этим требованиям, то с высокой вероятностью можно говорить о том, что речь идет об истинных
мутантах со стабильным фенотипом. В повседневной работе, когда целью является получение генетически маркированного штамма, главным является стабильность наследования признака. Для ее оценки следует определить уровень устойчивости. Лучше всего это сделать, используя критерий летальной дозы (LD). Например, LD2o — это такая концентрация агента, при которой эффективность клонирования устойчивых клеток снижается на 20 %. Используемые значения LD могут быть разными, однако при их выборе принимают во внимание тот факт, что кривые выживаемости имеют, как правило, S-образную форму. Верхнее и нижнее значения этой кривой не могут быть определены с высокой точностью, поэтому предпочтительно работать со значениями, приходящимися на середину кривой,— LD2o, LD50 или LD37. Устойчивые клетки сразу после их выделения культивируют в неселективных условиях в течение 30—50 клеточных поколений и сравнивают значения LD сразу после выделения и через 15, 30 и 50 клеточных поколений. Снижение LD по мере культивирования клеток в неселективных условиях будет указывать на потерю признака.
Примеры вариантов клеточных линий, устойчивых к ядам
Несмотря на огромное разнообразие вариантов клеточных линий по типу устойчивости, они могут быть сведены к трем группам: 1) изменение мишени; 2) изменение проницаемости плазматической мембраны к селективному агенту; 3) увеличение количества нормальной или измененной формы белка мишени вследствие увеличения дозы гена, кодирующего этот белок.
Устойчивость к аналогам нуклеотидов. Цитотоксическое действие 8-азагуанина было использовано для того, чтобы получить первые устойчивые к яду клетки в культуре [6]. Мутанты этого типа интенсивно изучались [5, 7—10], полученные данные внесли значительный вклад в генетику соматических клеток. Сами по себе аналоги гуанина — 8-азагуанин и 6-тиогуанин — не токсичны для клеток до тех пор, пока фермент ГГФРТ не превратит их в токсичные нуклеозиды. У клеток млекопитающих имеются две фосфорибо-зилтрансферазы, одна специфичная для гипоксантина, гуанина и ксантина — ГГФРТ, другая специфическая для аденина — АФРТ. Оба фермента участвуют в синтезе пуриновых нуклеетидов de novo и не являются жизненно необходимыми для размножения клеток в культуре. Ген ГГФРТ локализован на Х-хромосоме клеток грызунов и человека. В результате отбора клеток на яде (8-азагуанин или 6-тиогуанин) некоторые клетки способны выживать и давать начало колониям, так как у них отсутствует ГГФРТ и они не способны превращать аналоги в токсичные соединения.
Мутации, затрагивающие ген, кодирующий ГГФРТ, широко используются в генетике соматических клеток по следующим причинам: 1) устойчивые клетки имеют стабильный фенотип и могут быть получены практически из любой клеточной линии, включая первичные; 2) для селекции устойчивых клеток создана специальная
среда ГАТ, в состав которой входят гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Нормальные клетки размножаются на этой среде, а клетки, лишенные ГГФРТ, не могут из-за того, что аминоптерин ингибирует синтез пуринов и пиримидинов de novo; 3) обработка мутагенами значительно повышает число устойчивых вариантов; на различных клеточных линиях были разработаны модельные системы с использованием перехода ГГФРТ+/ГГФРТ_ для количественной оценки мутагенного действия химических соединений [11 —12]; 4) ГГФРТ была выделена и очищена, что сделало возможным получение антител и более подробное исследование мутантов, учитывая не только активность фермента, но и наличие иммунопреципитируемого белка. Вторая фосфорибозилтрансфераза (АФРТ), ответственная за фосфо-рибозилирование аденина, также превращает аналоги (8-азааденин и 2,6-диаминопурин) в токсичные соединения [13, 14]. За аденозин в клетке конкурируют два фермента — аденозинкиназа и аденозин-деаминаза, так что концентрация аденозина в клетке зависит от работы этих двух ферментов. Изменение аденозинкиназной активности может быть получено при селекции клеток на устойчивость к повышенным концентрациям аденозина или на устойчивость к таким агентам, как туберцидин (7-деазааденозин) или 6-метилтиопурин [15]. Из пиримидиновых аналогов наиболее часто для селекции используют 3-фтортимидин, 5-бромдезоксиуридин, 5-йоддезоксиури-днн и 5-фтордезоксиуридин. Клетки, устойчивые к этим агентам, лишены тимидинкиназы (ТК“), поэтому аналоги не фосфорили-руются и не включаются в ДНК [16, 17] .
