Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Получение кариотипа. Для повышения объективности карио-типического анализа клеток перевиваемых линий необходимо использовать микрофотографии. Съемку производят на пленку «Мик-рат-300», делая по 4—5 фотоотпечатков каждой метафазной пластинки. Изображение не должно быть излишне контрастным, так как прй этом снижается качество G-дисков и затрудняется идентификация хромосом. Кариотипы клеток получают путем вырезания хромосом из фотоотпечатков метафазных пластинок и наклеивания их согласно принятой для каждого вида системе расположения хромосом в нормальном кариотипе. В последнем, нижнем, ряду наклеивают маркерные хромосомы и редкие структурные перестройки (рис. 8, см. вклейку). Как правило, для определения типичного или модального кариотипа вполне достаточно проанализировать кариотипы 15 метафазных пластинок, окрашенных на G-диски. Эти метафазные пластинки должны удовлетворять следующим требованиям: 1) число хромосом в них не должно быть менее тех хромосомных чисел, которые установлены при анализе 100 рутинно окрашенных метафазных пластинок; 2) метафазные пластинки не должны содержать наложений, затрудняющих интерпретацию структурно перестроенных хромосом; 3) часть метафазных пластинок (не менее трех) должна иметь хромосомы прометафазного типа, пригодные для более точной локализации районов разрывов хромосом при образовании маркеров.
Для разграничения нормальных и структурно перестроенных хромосом следует использовать банк нормальных хромосом, сопоставляя каждую хромосому с образцами банка. Это позволяет выявить перестройки, затрагивающие небольшие фрагменты хромосом, в том числе терминальные и интерстициальные делеции.
Составление рядов идентичных маркерных хромосом. С этой целью дополнительные фотоотпечатки всех структурно измененных хромосом, выявленных при получении кариотипов, располагают таким образом, чтобы вертикальные ряды состояли из хромосом рдной клетки, а горизонтальные включали хромосомы одного типа из разных клеток, т. е. являлись бы рядами идентичных маркерных хромосом (рис. 9, см. вклейку). В процессе формирования рядов идентичности происходит разграничение маркеров и редких структурных перестроек. Порядок расположения маркеров в вертикальном ряду следующий: сначала убывающие по размеру метацентрические
хромосомы, затем субметацентрические и субтелоцентрические, в конце акроцентрические хромосомы. В последний горизонтальный ряд попадают однократно встретившиеся структурные перестройки.
Составление рядов идентичности является трудоемким, но важным- этапом кариотипирования, при котором происходят одномоментное сопоставление большого числа одинаковых маркерных хромосом из анализируемых клеток и их коррекция. Тем самым сводится к минимуму субъективность в интерпретации разных типов хромосом, что почти неизбежно вследствие различий в качестве дифференциального окрашивания хромосом в разных метафазных пластинках. На этом этапе формируется представление о морфологических типах маркеров, частоте их встречаемости и фрагментарном составе 70— 80 % всех маркерных хромосом.
Необходимо также подчеркнуть, что при работе с линией клеток нового вида, хромосомы нормального кариотипа которого недостаточно знакомы исследователю, в процессе составления рядов идентичности желательно оперировать всеми хромосомами, включая и нормальные. Указанный прием, а также постоянное использование банка нормальных хромосом позволят свести к минимуму ошибочную идентификацию как нормальных, так и маркерных хромосом в кариотипах.
Составление суммарной числовой таблицы нормальных и маркерных хромосом. Для обобщения результатов кариотипирования всех клеток составляют суммарную числовую таблицу, в которой представлено число хромосом данной клетки, число маркеров и число копий всех типов хромосом по всем анализируемым метафазным пластинкам (см. таблицу). При одномоментном сопоставлении всех хромосом по всем клеткам становится очевидным присутствие клеток, имеющих как идентичный, так и отличающийся состав нормальных и маркерных хромосом. С помощью такого приема кариотипирования устанавливается степень кариотипической изменчивости и стабильности отдельных хромосом, а также число гомологов (т. е. нулли-, моно-, ди-, трисомия и т. д.) для каждой нормальной хромосомы.
В целом таблица позволяет выявить взаимосвязь между числом копий определенных нормальных и маркерных хромосом. Показано, что нуллисомия нормальной хромосомы 8 всегда сочетается с наличием в клетках маркера Ms. Наоборот, в тех клетках, где есть один гомолог хромосомы 8, маркер Ms отсутствует. На основании этих корреляций можно предположить присутствие материала хромо-
Клетки, Число Число Нормальные хромосомы Маркерные хромосомы
1 2 3 4 5 6 7 8 22 X Mi Мг Мз м, Мб
1 46 и 1 1 1 0 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 --- 1
2 46 и 1 2 2 0 1 1 3 0 1 2 1 1 --- --- 1 1
3 47 12 / 2 / 0 1 1 3 1 1 I 1 I 1 I --- 1
