Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
20. Committee for a standardized karyotype of Rattus norvegicus //Cytogenet. Cell Genet. 1973. Vol. 12. P. 199—205.
21. Proc. First Intern. Conf. for the standardization;lof ibandeddkaryotypes of domestic animals / Eds С. E. Ford, D. L. Pollock', J.'GusMysssn.// Hereditas. 1980. Vol. 92. P. 145-162.
22. Yoshida М. C., Kodama Y. The C- and G-banding patters of chromosomes iri 17 strains of mice//Cytogenet. Cell Genet. 1983. Vol. 35. P. 51—56.
23. Miller D. A.. Tantravahi R., Newman B. et at. Karyotype of Friend virus-induced mouse ervthroleukemia cells //Cancer Genet. Cytogenet. 1979. Vol. 1. P. 103—113.
24. Dev V. G„ Tantravahi R.,., МШ'ёгг D; A., MilHdr 0. J. Nucleolus organizers in Mus museatus subspecies^ and the RAG cell line // Genetics. 1977. Vol. 86. P. 389*--398?
25. Unaktii W., Hsu Т. C. The'^-andilGSbaaiding^patiterns Rattus .norvegicus chromosomes // J. Nat. Cancer Inst. 1972. У6Ъ) 49. Й 1425—1431.
26. Sasaki М., Nishida C., Kodama Y. Characterization of silverstained nucleolus organizer regions (Ag-NORs) in 16 inbred strains of the norway rat, Rattus norvegicus //Cytogenet. Cell Genet. 1986. Vol. 41. P. 83—88.
27. Радоюабли.С.. И., Графодатский А. С. Атлас 'хромосом сельскохозяйственных и., лабораторных млекопитающих; Новосибирск, 1988. 102 с.
28. Мамаева С. Е., Литвиннур Л. Ф., Пинаев Г. П. Характеристика кариотипа постоянной клеточной.ллниин2. Изменчивость и сбалансиррваииость хромосомного набора клеток M-HeLa // Цитология.: 1986.; Т. 26. С. 199—203.
29. Hamlin J. L., Mttbrandt J. Г)/, Heintt~N\ Н.', Arizkhan J. С. DNA sequence amplification in mammalian cells // Intern. Rev. Cytol. 1984. Vol. 90. P. 31—82.
30. (Мамаева. C.E., Цвиленева H.? МЛ). Mamaeva Si.?„ Tsviteneva N. N. A study of chromosonrer content! of, Frrendd virus indiiaed mouse erythroleukemia cells (clone М2) via karyotype Teconstrtnctiomy'/ Cancer Genet. Cytogenet. 1985. Vol. 16. P. 199— 206.
31. Филатов Л. В., Мамаева С. Е. Стабильность кариотипа двух постоянных линий
клеток китайского хомячка СНО-К1 и V-79 // Цитология. 1985. Т. 27. С. 1031— 1038.
32. (Савельева J1. Г., Мамаева С. Е.) Savelyeva L. G., Mamaeva S. Е. Heterogenety and balance of chromosomes in human cell line M-HeLa-76. Analysis of 100 karyotypes // Cancer Genet. Cytcgenet. 1987. Vol. 28. P. 311—325.
Определение видовой специфичности культивируемых клеток с помощью изофермеитного анализа
Б. А. Маргулис
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Определение видовой специфичности необходимо для выявления в культуре примесных клеток, а также для анализа процессов, происходящих при культивировании клеток и при создании клеточных гибридов. Эта задача может быть решена с помощью изофермент-ного анализа [1]. По принятому сейчас определению, изоферментами являются ферменты с одинаковой субстратной специфичностью, которые представляют собой результат экспрессии одного или нескольких структурных генов, имеющихся в геноме вида. Изоферменты могут отличаться друг от друга по своим физико-химическим параметрам, например по заряду, что позволяет разделять их с помощью электрофореза (ЭФ) в крахмальном, агарозном или полиакриламидном (ПААГ) гелях [2] (подробно об ЭФ см. [3, 4]). В данном сообщении основное внимание уделено методам ЭФ и последующего анализа'спектра изоферментов применительно к проблемам типиро-вания клеточных культур. Процедура состоит из следующих этапов:
1) приготовление клеточного лизата (пробы); 2) ЭФ белков на каком-либо из перечисленных выше носителей; 3) гистохимическое выявление зон изоферментов.
Приготовление клеточных проб
Большинство ферментов, используемых для типирования клеточных линий,— гидрофильные белки, поэтому их выявление проводят в неденатурирующих белок условиях. Клетки суспензируют в гипотоническим растворе, содержащем 0.01 М Трис-НС1, pH 7.0—7.5 или
0.005—0.01 М фосфатный буфер, pH 6.8—7.4, а также 0.001—0.002 М ЭДТА.1 Концентрацию клеток в суспензии можно варьировать в пределах 5 • 106—5 ¦ 107 клеток в 1 мл буферного раствора. Разрушение клеток достигается 3-кратным замораживанием—оттаиванием, пропусканием через шприц или введением в пробу за полчаса до нанесения на гель неионного детергента, Тритона Х-100, в концентрации до 1.0% [5]. Процедура замораживания—оттаивания может привести к частичной дезактивации ферментов, однако ЛДГ и Г6ФДГ выдерживают такую обработку, и их пробы могут храниться не менее года при —70 °С [6]. Экстракция детергентом значительно повышает
2 Приводится количество веществ на 1 л готового раствора.
выход белков в раствор, однако для каждой клеточной линии желательно устанавливать неденатурирующую белок концентрацию Тритона. Полученные пробы центрифугируют при 8000— 10 ООО об/мин, после чего в образцы вводят до 10—15 % сахарозы для увеличения плотности при наслаивании на гель. Готовые пробы наносятся сразу на гель или могут храниться (в расфасованном виде) в течение нескольких недель при —20 °С или дольше при -70 °С.
Электрофорез
Для анализа изоферментов используют ЭФ в крахмале, агарозе, ПААГ или на целлюлозных пленках [4]. Наиболее высокой разрешающей способностью обладает метод ЭФ в ПААГ. Конструкция прибора для ЭФ выбирается с учетом следующих требований: 1) простота в пользовании (вертикальный блок для ПААГ, горизонтальный— для крахмала или агарозы); 2) возможность охлаждения прибора; 3) возможность точного сравнения спектров изоферментов нескольких клеточных экстрактов на одном геле (блоке геля).
