Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
-f
Окрашивание хромосом {
В настоящее время цитогенетики располагают широким спектром методов окрашивания хромосом, демонстрирующих различные стороны их морфофункциональной организации. Здесь мы остановимся на четырех основных методах, достаточно информативных как для получения количественных и качественных кариотипических характеристик, так и для точной идентификации структурно-перестроенных хромосом.
Рутинная окраска. Для рутинного окрашивания необходимо отобрать 2—3 препарата, содержащих достаточное количество метафазных пластинок с сохранившейся цитоплазмой (рис. 1, см. вклейку). Окрашивание производят в течение 5—7 мин 1 %-ным красителем Гимза («Merck»), приготовленным на фосфатном буфере :Л (pH 6.8). Краску смывают проточной холодной водой, препараты й высушивают на воздухе и заключают в канадский бальзам. Получен-ные препараты используют для определения количественных карио-
Цитогенетические признаки} идентификации постоянных
Рутинная }
Акроцентрические хромосомы :
мышь (2п-40) бык (2п -60) собака (2п - 78)
Тип Группа А
мышь бык собака человек зеленая
мартышка
С=диски Все Все Некоторые 1, 9,16, Y Все, У
f\h\ А Л Л/1 л Ллм
*4 12,15,16,18,19 ЛАД ЛЛЛ 13-15 21-22 йй
flhfifift ЯК ЯЛ
Рис. 4. Характер С- и Ag-окрашивания хромосом ряда видов, способствующий определению видовой принадлежности клеточных линий.
типических характеристик. Исключение составляют клетки мышей, где для получения количественных характеристик используют хромосомы, окрашенные на С-диски (рис. 2, см. вклейку).
Дифференциальное окрашивание на G-диски было впервые предложено Сибрайт [4], после чего неоднократно модифицировано многими авторами [5—7]. G-окрашивание хромосом является наиболее распространенным и информативным из всех методов дифференциального окрашивания. С его помощью определяют гомологи нормальных хромосом и структурно перестроенные хромосомы. Для проведения G-окрашивания отбирают препараты, содержащие достаточное количество метафазных пластинок без цитоплазмы
используемые для межвидовой клеточных ланий человека и животных
окраска
Мета центрические, субметацентрические и акроцентрические хромосомы ••
человек (2п - 46) макака (2п -42)
зеленая мартышка (2п=60) овца (2п =54)
хомячок сирийский (2п =44) крыса (2п =42)
Хомячок китайский (2п =22) свинья (2п =38)
Группа Б
сирийский китайский макака овца крыса свинья
хомячок хомячок
X,Y ю, у, XJ Все, У ХЛЛАЛ Мало 1, 13- 18
!\А X* xlK ХМ, К ЛЯ
нш Мм п 1, 2,3, 4, 25 3, 11, 12 8, 10
ШЛл ш IV
Рис. 4 (продолжение).
с хромосомами средней длины и параллельно лежащими хромати-дами. Для окрашивания выполняют следующие процедуры:
1) высушивание препаратов в термостате при температуре 37 °С в течение 1—3 сут или при температуре 60 °С в течение 2—3 ч;
2) обработка препаратов 0.25 %-ным раствором трипсина (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва) или 0.01 %-ным раствором трипсина («Difco»), приготовленным на PBS, время экспозиции в трипсине и температура раствора могут быть изменены соответственно в пределах от 15 с до 2 мин и 20—30 °С в зависимости от качества G-окрашивания (рис. 3, см. вклейку); 3) споласкивание в трех порциях дистиллированной воды; 4) окрашивание 1 %-ным раствором Гимза на фосфатном буфере (pH 6.8) в течение 5—6 мин;
5) ополаскивание холодной проточной водой и высушивание на воздухе; 6) анализ метафазных пластинок под микроскопом (объектив Х40; окуляр X 10) с целью контроля качества G-окрашивания и внесения соответствующей коррекции в дальнейший процесс трипсинизации; 7) отбор препаратов с хорошим качеством G-дисков и заключение их в канадский бальзам (рис. 3, б).
Дифференциальное окрашивание на С-диски. Этот способ дифференциального окрашивания впервые описан Самнером [8] и используется для выявления структурного гетерохроматина. Метод является дополнительным приемом анализа структурно перестроенных хромосом. В ряде случаев он способствует установлению видовой принадлежности клеток [9] (рис. 4).
Для выявления С-дисков выполняются следующие процедуры: 1) высушивание препаратов в термостате при температуре 37°С в течение 1—7 сут.; 2) обработка 0.2 н. НС1 в течение 10—15 мин;
3) споласкивание в трех порциях дистиллированной воды по 1 мин в каждой;4) обработка NaOH ' в течение 30 с; 5) споласкивание в трех сменах раствора 2SSC;2 6) инкубирование в растворе 2SSC в течение 18—24 ч при температуре 65 °С; 7) споласкивание стекол в растворе 2SSC в течение 1 мин при комнатной температуре; 8) обезвоживание при помощи серии спиртов повышающейся концентрации (70 и 96 %-ный) по 2—3 с в каждом; 9) окрашивание 3 %-ным красителем Гимза на фосфатном буфере (pH 6.8) 10—20 мин; 10) промывание в холодной проточной воде и высушивание на воздухе; 11) отбор препаратов с удовлетворительным качеством С-дисков (рис. 2 и 5, см. вклейку) и заключение их в канадский бальзам.
