Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
При использовании ПААГ таким требованиям удовлетворяют вертикальный прибор, описанный нами ранее [7], и недавно выпущенная модель Phast System («Pharmacia», Uppsala, Швеция). Следует отметить, что ПААГ выгодно отличается от других перечисленных выше носителей не только повышенной разрешающей способностью, но и остротой зон, прозрачностью и большей механической прочностью [4]. Применение крахмала или агарозы позволяет упростить (по сравнению с ПААГ) процедуру ЭФ, но увеличивает опасность появления артефактных полос вследствие электроэндоосмоса в геле и снижает разрешение.
Для большинства ферментов в ПААГ используют буфер 0.04 М Трис-НС1, pH 8.9, а в электродном растворе — 0.005 М Трис, 0.0384 М глицин (или 0.025 М и 0.192 М соответственно), pH 8.3 [8]. Хорошие результаты при разделении дегидрогеназ в ПААГ достигаются с использованием буферной системы: 0.05 М Трис-ЭД'ГА-борат, pH 8.0, или 0.0625 М Трис-ЭДТА-борат, pH 9.0, в геле и электродных камерах. Концентрацию акриламида и метиленбис-акриламида можно изменять в пределах 5—7.5 % и 0.15—0.22 % соответственно; оптимальными для разделения изоферментов ЛДГ являются 5.5 и 0.18 % [8]. При использовании однородной буферной системы (один буфер в геле и электродном растворе) для удаления продуктов полимеризации проводят преэлектрофорез в течение 2—24 ч при слабом токе.
В работе Шоу и Прасада [9] предложено 20 буферных систем для ЭФ в крахмальном геле с указанием изоферментов, которые разделяются в этих системах. Ниже приводятся буферные системы, используемые для идентификации клеточных линий при помощи ЭФ в крахмале [6].
1. Трис-цитратный буфер (ТЦ): 0.14 М Трис, 0.043 М лимонная кислота, pH 7.1; в катодной камере — однократный (IX) буфер, в анодной — 0.8ХТЦ, в геле — 0.07ХТЦ.
2. Трис-ЭДТА-боратаый буфер (ТЭБ): 0.18 Мтрис, 0.004 М ЭДТА,
0.1 М борная кислота, pH8.6; в катодной камере — IXТЭБ, в анодной — 0.8ХТЭБ, в геле — 0.1ХТЭБ.
Для НАДФ-дегидрогеназ в катодныйбуфер вводится 20 мг НАДФ на 1 л раствора.
3. Трис-гистидмновый буфер (ТГс): 0.2 М трис титруется гистиди-ном-HCl до pH 8.0; в катоднойккзм^ре — IX ТГ'с, в анодной — 0.8Х ХТГс, в геле — О.БХТГс.
Условия ЭФ (ток, напряжение, время) определяются ионной силой и составом буферной системы, размерами и типом геля-но-сителя и конструкцией ^прибора дйя ЭФ [4]. Пробы, наносимые на дорожку геля, должны содержать белок с общей концентрацией в пределах 0.2—0.5 мг/мл. Для привязки спектра изоферментов исследуемых клеток к< стандартному на. крайние доршкки гелевого блока наносятся тканевые экстракты, пдаученныеьвз'мышцы, сыворотки крови юти печени таким, же способом, как клеточные препараты.
Гистохимическое выявление изоферментов
Для определения -изоферментного еспектра используется не-.с коль ко методических разработок, включая окрашивание крахмального или агарового отпечатка с геля, в котором проходило разделение, и окрашивание самюоо 1 разделяющего геля. (Остановимся на втором способе. Смееь для 1 гистохимической реакции обычно состоит и? буфера с оптимальным для развити'яреакции pH, из субстрата или его аналога, кофактора фермента или (если необходимо провести двухступенчатую*реакцию) дополнительного фермента, хро-мюгена, селективных , ионда iи т. д. Очевидно, «то метод окраски, ^который применяете дая чцсрахмального или агарозного геля, 'можно использовать для ПААГ. Ниже приведен список рецептов, "по которым приготавливаются смеси для .определения активности ферментов в геле, указаны конечные концентрации веществ в смеси и порядок смешивания коютакентов.
Лактат дегидрогеиаза
ЭФ в ПААГ [8]:
0.1 М Na-фосфэтиый буфер, pH 744, 0.1 М Na-лактт,
0.01 М Nadi,
5 • ю-4 М ща2,
1 мг/мл НАД,
0.25 мг/мл НБТ,
0.025 мг/мл ФМС.
ГгЭФи в-системе ТЦ t [9J: '0.075 М Трис-НС1, pH 7.0, 0.1 М Na-лактат,
5 ¦ 10~3 М NaCN,
0.5 мг/мл НАД,
0.3 мг/мл НБТ,
¦ .0.02 мг/мл ФМС.
Инкубация г геля в растворе при 37 °С в темноте .в течение 10—20 мин, после чего на желтоватом ф©не появляются синие ! полосы.
ЭФ в системе ТЭБ [6]:
0.05 М Трис-НС1, pH 7.5,
6 • 10_3 М Na2-rлюкoзo-6-фocфaт, 0.025 М MgCl2,
0.2 мг/мл НАДФ,
0.1 мг/мл МТТ,
0.03 мг/мл ФМС.
ЭФ в крахмальном геле [9]:
0.11 М 'Грис-НС1, pH 7.1,
6 • 10_3 М №2-глюкозо-6-фосфат, 0.3 мг/мл НАДФ,
0.2 мг/мл НБТ,
0.02 мг/мл ФМС.
Инкубация при 37 °С в темноте в течение 1 ч или более до появления темно-синих зон.
Малатдегидрогеиаза
ЭФ в системе ТЭБ [6]: 0.05 М Трис-НС1, pH 7.1, 1 мг/мл Na-малата,
0.25 мг/мл НАД,
0.1 мг/мл МТТ,
0.03 мг/мл ФМС.
ЭФ в системе ТЦ [9]: 0.075 М Трис-HCl, pH 7.1, 0.1 М №-малат;
5 • 10~3 М NaCN,
0.5 мг/мл НАД,
0.3 мг/мл НБТ,
0.02 мг/мл ФМС.
Условия инкубации см. в рецепте для ЛДГ.
6-Фосфоглюкоиатдегидрогеназа
ЭФ в системе ТЭБ [6J:
0.075 М Трис-HCl, pH 7.0,
2 мг/мл 6-фосфоглюконата Na, 0.2 мг/мл НАДФ,
0.1 мг/мл МТТ,
0.03 мг/мл ФМС.
ЭФ в крахмальном геле [9]: 0.05 М Трис-HCl, pH 7.1,
2 мг/мл 6-фосфоглюконата Na, 0.2 мг/мл НАДФ,
