Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Снятие клеток со стекла. По окончании действия цитостатика среду культивирования в монослойных культурах осторожно сливают в центрифужные пробирки, на дно культуральных флаконов наливают 2—4 мл подогретой до 37 °С смеси 0.25 %-ного трипсина и 0.2 %-ного версена в соотношении 1 : 1 и ставят в термостат при 3J7 °С. Через 3—10 мин в зависимости от степени адгезии клеток содержимое центрифужных пробирок выливают в культуральный флакон и встряхивают его несколько раз. Следует подчеркнуть,
что нельзя стремиться к полному отделению монослоя со дна флакона, так как это может привести к разрушению отделившихся в первую очередь митотических клеток и увеличению доли интерфазных клеток. Суспензию с клетками переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 6 мин при 1000 об/мин.
Клетки суспензионных культур после окончания действия цитостатика вместе с питательной средой сразу переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 6 мин при 1000 об/мин. По окончании центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, оставляя 0.5 мл для ресуспензирования осадка с помощью механического потряхивания.
Обработка клеток гипотоническим раствором. Данный этап предусматривает постепенное набухание клеток, что приводит к улучшению разброса хромосом в метафазной пластинке. Для этого к осадку небольшими порциями, первоначально по 1—2 капли, при постоянном встряхивании для получения равномерной суспензии клеток добавляют гипотонический раствор либо комнатной температуры, либо подогретый до 37 °С. Объем его определяется количеством клеточной массы и составляет обычно 6—8 мл. Для этой цели используют 0.56 %-ный раствор хлористого калия или смесь 0.56 %-ного раствора хлористого калия и 1 %-ного раствора цитрата натрия в соотношении 1:1.
Длительность гипотонического воздействия и сам раствор подбирают эмпирически. Для определения оптимального режима гипотонии и получения достаточного количества метафазных пластинок хорошего качества следует использовать несколько вариантов гипотонический обработки клеток в одном опыте.
Для большей части постоянных клеточных линий человеческого и мышиного происхождения оптимальным режимом является 20— 30-минутная обработка гипотоническим раствором второй модификации при комнатной температуре либо подогретым до 37 °С. Однако клетки некоторых человеческих линий, таких как К-562 и RH, требуют более длительного гипотонического воздействия (50—60 мин), направленного на полное освобождение метафазных пластинок от цитоплазмы и получение хорошего разброса хромосом.
В то же время многие линии крысиного происхождения (трансформированные эмбриональные фибробласты, глиомы и др.) и линии клеток китайского и сирийского хомячка предпочтительнее обрабатывать хлористым калием, изменяя время гипотонического воздействия в зависимости от типа клеток от 15 до 50 мин.
Фиксация клеток. По окончании гипотонической обработки клетки центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспензируют и осторожно, по каплям, добавляют 5—6 мл фиксатора, постоянно встряхивая клетки, чтобы избежать образования комочков.
Через 15—20 мин фиксатор после центрифугирования заменяют новой порцией, повторив эту процедуру 2 раза. В окончательной порции объем фиксатора в зависимости от количества клеток составляет 1—3 мл. Рекомендуется начать приготовление препаратов сразу
после окончания фиксации, так как хранение клеток в последней порции фиксатора может привести к конденсации хромосом и ухудшению их морфологии.
Приготовление препаратов. Различные способы приготовления препаратов могут отразиться на качестве метафазных пластинок. Необходимо учитывать, что требования к качеству препаратов на отдельных этапах хромосомного анализа не одинаковы и зависят от задач и целей исследования. Обычно в работе используют следующие способы приготовления препаратов: 1) раскапывание клеток (по 3 капли) с высоты 20—30 см на обезжиренное мокрое охлажденное стекло и высушивание на воздухе; 2) раскапывание клеток на сухое чистое стекло, лежащее на рельсах над водяной баней, нагретой до 40—50 °С, и высушивание на воздухе; 3) раскапывание клеток (по 5—6 капель) на мокрое охлажденное стекло и высушивание с помощью выжигания фиксатора.
Обычно готовят 1—2 пробных препарата из различных вариантов и в зависимости от результата выбирают наиболее адекватный способ.
Наш опыт показал, что первые два приема способствуют лучшему сохранению целостности метафазных пластинок и получению препаратов, пригодных как для количественного, так и качественного анализа хромосом в линиях. В то же время высушивание препаратов выжиганием дает возможность улучшить разброс хромосом в метафазных пластинках, если гипотоническое воздействие оказалось недостаточным, а также освободить их от цитоплазмы, препятствующей дифференциальному окрашиванию хромосом на G-диски.
Приготовление препаратов контролируют под микроскопом, меняя в зависимости от полученных результатов густоту суспензии, силу нанесения суспензии на стекло и характер высушивания. Для проведения полного цитогенетического анализа обычно бывает достаточно 15—20 стекол. j
