Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Локализация «горячих точек» на хромосомах
Точки разрывов хромосом при образовании маркеров и редких структурных перестроек («горячие точки») наносят на схему хромосом соответственно тем G-дискам, по которым происходит разрыв. Рисунок распределения «горячих точек» служит важной кариологиче-ской характеристикой линии, отражающей нестабильность определенных районов хромосом в анализируемых линиях (рис. 12, а я б).
13
19
1?
20
15
16
17
1 000
21
18
22
Рис. 12. Локализация «горячих» точек, возникающих при образовании маркеров (/) и редких структурных перестроек (2) в линии Raji (а) и M-HeLa-76 (б).
Анализ «горячих точек» на хромосомах свидетельствует о неслучайном характере их распределения в зависимости от типа культивируемых клеток как между отдельными хромосомами, так и по их длине. Показано, что в линиях, возникающих из опухолевых и лейкоз-ных клеток различного гистогенеза, распределение «горячих точек» может существенно отличаться. Картина распределения «горячих точек» на хромосомах является морфологическим выражением молекулярно-биохимических процессов, связанных с численными и структурными изменениями различных генов на хромосомах, в том числе и онкогенов.
Ошибки, допускаемые при проведении хромосомного анализа
Потеря митотических клеток возможна на этапе обработки монослоя трипсином или версеном, когда слабо прикрепленные делящиеся
•1 °2
Рис. 12 (продолжение).
клетки либо сливают вместе с раствором трипсина, либо разрушают их при длительной обработке. В итоге на препарате видны многочисленные интерфазные клетки и единичные митотические. Другой причиной потери митотических клеток может быть чрезмерная гипотоническая обработка, приводящая к набуханию, слипанию и разрушению клеток. Кроме того, значительная потеря митотических клеток может быть связана с образованием клеточных комков, которые чаще всего возникают при обработке и центрифугировании большого количества клеток. Чтобы избежать этого, необходимо соответствующее разведение клеточной массы, а также обязательное встряхивание и осторожное пипетирование клеточного осадка, образующегося после каждого центрифугирования.
Наличие в препаратах небольшого количества митозов, но хорошего качества может быть связано с низкой пролиферативной активностью клеток в культуре. В этом случае помогает увеличение времени экспозиции в колхицине до 3—4 ч.
Большое количество митозов с сильно спирализованными хромосомами ча.ще всего обусловлено либо избыточными концентра-
циями колхицина или колцемида в культуре, либо удлинением срока их действия. В этом случае концентрация колхицина и (или) время экспозиции клеток в колхицине должны быть уменьшены.
Если в пробных препаратах митозов достаточное количество, но большинство из них находится в цитоплазме и содержит много наложений, то улучшение качества препаратов может быть достигнуто при помощи метода выжигания фиксатора или благодаря увеличению времени гипотонической обработки в повторном эксперименте.
Если в пробном препарате встречается большое количество неполных метафазных пластинок, а также отдельно лежащие хромосомы,
то для улучшения качества препаратов следует использовать более щадящий способ их приготовления, включающий нанесение суспензии фиксированных клеток на сухие стекла, помещенные над водяной баней с температурой 40—45 °С, или уменьшение времени гипотонической обработки в повторном опыте.
Плохое качество G-дисков чаще всего может быть связано с использованием старых (со сроком хранения больше месяца) или недостаточно высушенных препаратов. Кроме того, качество G-дисков резко ухудшается на хромосомах, лежащих в цитоплазме, а также при использовании партий трипсина плохого качества. Как уже упоминалось, в наших условиях лучше всего зарекомендовал себя отечественный трипсин, приготовленный Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов (Москва), а также трипсин фирмы «Difco». Однако решающим моментом для получения высококачественных G-окрашенных хромосом во многих случаях следует считать тщательный подбор оптимального режима трипсинизации (температуры раствора, времени экспозиции) для каждой партии препаратов.
Чтобы свести к минимуму возможные ошибки при кариоти-пировании клеточных линий, необходимо тщательно соблюдать все перечисленные выше этапы цитогенетического анализа, обращая особое внимание на использование банка образцов нормальных хромосом и рядов идентичности маркерных хромосом.
Многолетний опыт работы с большим количеством постоянных линий человека и животных показывает, что пренебрежение даже одним из этапов кариологического анализа может привести к неправильной интерпретации полученных результатов, что затрудняет сопоставление данных, публикуемых разными авторами. Стандартизация проведения всех этапов цитогенетического анализа повысит объективность и соответственно ценность результатов исследования кариотипов культивируемых клеток.
