Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
0.25 мг/мл НБТ,
0.02 мг/мл ФМС.
а- Г лицерофосфатдегидрогеназа
ЭФ в системе ТЦ [9]:
0.075 М Трис-HCl, pH 7.1,
1 • 10~4 М а-глицерофосфат Na,
5 • 10_3 М NaCN,
0.5 мг/мл НАД,
0.3 мг/мл НБТ,
0.02 мг/мл ФМС.
Алкогольдегидрогеиаза
ЭФ в системе ТЦ [9]:
0.025 М Трис-HCl, pH 7.1,
3 мл 95 %-ного этанола на 100 мл инкубационной смеси,
5 • 10~3 М NaCN,
0.5 мг/мл НАД,
0.3 мг/мл НБТ,
0.02 мг/мл ФМС.
Глютамат-оксалацетаттраисамииаза
ЭФ в системе ТЦ [6]:
0.02 М Na-фосфэтный буфер pH 7.0,
4.4 мг/мл L-аспарагиновой кислоты,
2.4 мг/мл а-кетоглютарата,
0.01 мг/мл пиридоксаль-5-фосфата,
5 мг/мл красителя Fast Blue ВВ salt.
ЭФ в системе ТЦ [9]:
0.1 М фосфатный буфер, pH 7.0,
5.3 мг/мл L-аспарагиновой кислоты, 0.7 мг/мл а-кетоглютарата,
0.5 мг/мл пиридоксаль фосфата,
2 мг/мл красителя Fast violet В salt.
Смесь фильтруется и непосредственно перед употреблением в нее вводится краска. Гель инкубируется при 37 °С до появления красных или оранжевых зон и затем фиксируется в глицерине.
ЭФ в системе ТЦ [6]; ЭФ в системе ТЦ [9]: '!-
0.075 М Трис-НС1, pH 8.0. 0.05 М Трис-НС!, pH 7.1, ;
2 мг/мл глюкозо-1-фосфата, 2 мг/мл глюкозо-1-фосфата, '*
2.5- Ю“3 м Mgci2, 5- io-3MMgci2,
10 ед Г6ФДГ на 100 мл инкубационной 80 ед Г6ФДГ на 100 мл инкубационной
CNiecn, смеси, *.
0.1 мг/мл МТТ, 0.2 мг/мл НБТ, 1
0.03 мг/мл ФМС. 0.01 мг/мл ФМС.
В смесь дополнительно входит фермент Г6ФДГ, препарат кото- i рого должен содержать 100—250 ед/мл («Sigma» США или «Behringer» ФРГ). Гель инкубируется при 37 °С в темноте до появления темно-синих зон.
Супероксиддисмутаза Пурии-иуклеозидфосфорилаза
ЭФ в системе ТЭБ [6]: ЭФ в системе ТЭБ [6]:
0.01 М Na-фосфэтный буфер, pH 7.0, 0.01 М Na-фосфэтный буфер, pH 7.0,
0.2 мг/мл НАДФ, 1 мг/мл изозима,
0.1 мг/мл МТТ, 1 мкл/мл (100 мг/мл) ксаитиноксидазы,
0.03 мг/мл ФМС. 0.1 мг/мл МТТ,
0.03 мг/мл ФМС.
После инкубации геля зоны фермента видны на просвет.
Все смеси могут быть приготовлены из концентрированных исходных растворов. Необходимо учитывать, что растворы НАД, НАДФ, субстратов (лактата, малата, глюкозо-6-фосфата и т. д.), НБТ могут храниться не более недели при 4 °С; раствор ФМС должен храниться в темноте и использоваться в течение 12 ч. Ферментативную реакцию, развивающуюся в геле, останавливают промывкой последнего в воде. Фиксация геля чаще всего проводится в 50 %-ном глицерине.
Ниже описывается метод, который мы используем для идентификации клеточных линий.
Клетки (5 • 106 —10 • 106) после промывания в фосфатно-солевом буфере суспензируются в 0.3—0.5 мл 0.01 М Трис-НС1, pH 7.5. После трехкратной процедуры замораживания в жидком азоте с последующим оттаиванием и центрифугирования в пробу добавляется сахароза (хч) до концентрации 10 %. Состав геля: 5 %-ный (для ЛДГ) или 7 %-ный (для Г6ФДГ) акриламид («Serva»), 0.2 %-ный метиленбисакриламид («Serva»), 0.375 М Трис-НС1, pH 8.9. В качестве электродного буфера используется раствор: 0.025 М Трис-HCl («Reanal»), 0.192 М глицин («Reanal»), pH 8.3—8.6.
ЭФ проводится в приборе с вертикальным блоком [7] при начальном токе 20 мА (30—40 мин), рабочий ток 40 мА на блок. Прибор во время опыта погружен в ледяную ванну — 0—4 °С. После электрофореза гели помещаются для окраски в один из следующих растворов.
1. ЛДГ: 100 мл 0.1 М Трис-HCl, pH 7.0, 200 мг Ыа-лактата («Sigma», США), 20 мг НАД («Sigma» или «Reanal»), 15 мг НБТ («Sigma» или «Reanal»), 3 мг ФМС («Reanal»).
2. Г6ФДГ: 100 мл Трис-HCl, pH 8.0, 70—90 мг глюкозо-6-фосфата («Sigma»), 15 мг НАДФ («Reanal»), 1 • 10”3 М MgCh, 20 мг НБТ, 3—4 мг ФМС.
Инкубация происходит в темноте при 37 °С в течение 20—40 мин для ЛДГ и 60—120 мин для Г6ФДГ.
Результаты по изоферментному анализу клеточных линий, полученные в разных исследовательских группах, показывают, что наиболее простыми и воспроизводимыми являются методы выявления ЛДГ, Г6ФДГ и МДГ. Способы обнаружения других активностей сложнее и требуют внесения в схему окраски дополнительных ферментов. Компания «Corning medical scientific» (Mass. 02032, США) выпускает наборы Autentikit для определения семи ферментов: ЛДГ, Г6ФДГ, нуклеозидфосфорилазы, пептидазы В, аспартат-аминотранс-феразы и манноза-фосфатизомеразы. С помощью этих наборов можно различать клетки млекопитающих, относящихся к 12 разным видам.
Исследования, ведущиеся в настоящее время, сосредоточены на двух направлениях: упрощение электрофоретического метода с использованием готовых целлюлозных пленок и создание иммуно-химических (дополнительно к гистохимическим) наборов для выявления отдельных групп ферментов.
