Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Диффёренциальное окрашивание ядрышковых организаторов (ЯО) с помощью нитрата серебра. Впервые метод был предложен Хоуэлом с соавторами [10] и усовершенствован рядом авторов [11, 12]. Он позволяет выявить специальные участки хромосом — ядрышковые организаторы, активно синтезирующие рйбосомную РНК [13]. Обнаружение серебрящихся районов в маркерных хромосомах способствует определению их фрагментарного состава. Специфичность окраски хромосом AgN03 для многих видов животных может стать определяющей при установлении видовой принадлежности клеток исследуемой клеточной линии [9] (см. рис. 4).
Препараты, предназначенные для серебрения ЯО, хранятся при комнатной температуре и могут быть использованы для окраски этим методом в течение 1—6 мес в отличие от рассмотренных выше методов дифференциального окрашивания хромосом. Возраст препаратов не играет существенной роли при Ag-окрашивании, наоборот, серебрение ЯО на свежеприготовленных препаратах нежелательно, так как это сопровождается ухудшением морфологии хромосом. Порядок окрашивания хромосом следующий: 1) нанесение 4 капель
1 Приготовление раствора: NaOH — смешать 10 мл свежеприготовленного раствора 0.07 н. NaOH (2.8 г/л) с 60 мл свежеприготовленного раствора 2SSC.
2SSC: 0.30 М NaCl (17.4 г/л) и 3.03 М трехзамещенный цитрат натрия (8.82 г/л).
50 %-ного раствора AgNC>33 и 2 капель проявителя4 на препарат, помещенный во влажную камеру (температура 60—65 °С); равномерное распределение смеси растворов по всей поверхности предметного стекла с помощью покровного стекла; 2) экспонирование препарата с красящим раствором в течение 4—6 мин до появления темно-коричневого оттенка красящего раствора; 3) споласкивание в трех сменах дистиллированной воды; 4) окраска 1 %-ным раствором Гимза («Merck») на фосфатном буфере (pH 6.8) в течение 20 с;
5) промывание холодной проточной водой и высушивание на воздухе;
6) заключение в канадский бальзам.
На удовлетворительно окрашенном препарате видны ядра и хромосомы желто-коричневого цвета с темными гранулами серебра в районе ядрышек и Ag-позитивными ЯО на хромосомах (рис. 6, см. вклейку). Окрашенные препараты хранят в темноте при комнатной температуре, длительное хранение препаратов может привести к обесцвечиванию гранул серебра.
Количественный анализ
метафазных пластинок
Модальный класс клеток и интервал изменчивости числа хромосом определяют при подсчете 100 рутинно окрашенных метафазных пластинок, что, как доказано нами экспериментально, вполне достаточно для получения количественных характеристик. Проведение этого этапа исследования требует использования метафазных пластинок с сохранившейся цитоплазмой, умеренной спирализацией хромосом, расположенных отдельно друг от друга, без наложений, затрудняющих подсчет. Не допускается использование хромосомных препаратов с разбросанными единичными хромосомами, что свидетельствует о нарушении целостности многих метафазных пластинок в период гипотонического воздействия или на этапе приготовления препаратов.
Подсчет числа хромосом выполняют непосредственно под микроскопом (объектив Х90—100, окуляр X Ю—15), если по предварительной оценке число хромосом не превышает 60. При значениях хромосомных чисел более 60, а также в случае затруднений, возникающих при оценке числа некоторых перестроек хромосом в карио-типе, точный подсчет может быть выполнен только на микрофотографиях. При подсчете модального класса исключаются полиплоидные клетки любого класса плоидности.
Если в нормальном кариотипе присутствует большое число акро-центрических хромосом, как, например, у мыши и быка, более объективные результаты могут быть получены при подсчете хромосом на С-окрашенных метафазных пластинках, морфология которых в отличие от рутинно окрашенных позволяет легко дифференцировать робертсоновские транслокации от близко расположенных акро-центрических хромосом (см. рис. 2, вклейка).
3 2 г AgNC>3 растворяют в 4 мл деионизированной воды.
4 200 мг сухой желатины растворяют в 10 мл деионизированной воды с добавлением 0.1 мл муравьиной кислоты.
85
I
Как правило, в любой линии модальный класс клеток выявляется легко, а интервал изменчивости не превышает 3—5, реже 6—8 хромосом. Однако в пределах одного модального класса, т. е. среди клеток с одним и тем же числом хромосом, могут быть клетки с различным кариотипом. В таком случае выделяют модальный или типичный кариотип линии, т. е. кариотип доминирующей группы клеток с идентичным набором нормальных и маркерных хромосом.
Модальное число хромосом является довольно стабильной величиной в длительно ведущихся клеточных линиях, прошедших в культуре не менее 100 пассажей. Примером такой линии является лимфо-бластоидная линия Raji, число хромосом в клетках которой в сублиниях с различным кариотипом сохраняется равным 48 на протяжении многих лет культивирования. В то же время в некоторых линиях модальный класс клеток существенно меняется в процессе длительного культивирования. Ярким примером таких непрерывных изменений является линия клеток HeLa, модальное число хромосом в клетках различных сублиний которой меняется от 49 до 82 [14].
