Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Xki ’ ‘Ж ж
77
Ч а с т ь 2 /
I
Методы анализа j культивируемых клеток
Хромосомный анализ культивируемых клеток
С. Е. Мамаева
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Совершенствование методов дифференциального окрашивания хромосом и комплексное использование этих методов для цитогенетического анализа привели к принципиально новым заключениям
о кариотипической уникальности каждой клеточной линии и о возможности узнавания ее среди множества других линий различного видового происхождения.
В последнее время постоянные опухолевые и лейкозные клеточные линии стали широко использоваться в качестве объекта совместных исследований цитогенетиков и молекулярных биологов. Было установлено, что большинство специфических перестроек хромосом совпадает с местами локализации протоонкогенов [1,2], что в свою очередь привело к пониманию ряда важных закономерностей в злокачественной трансформации клеток и одновременно явилось мощным стиму-,ло.м для ‘ комплексного использования различных методов цитогенетического анализа клеток постоянных линий.
В то же время хорошо известно, что такие факторы культивирования, как нестандартность питательных сред и сывороток, вирусы и микоплазма, могут явиться причиной дестабилизации различных клеточных характеристик, в том числе и кариологическнх.
Еще не решена такая остро стоящая перед исследователями проблема, как внутривидовая и межвидовая контаминация клеток [3]. В то же время отсутствие надлежащего цитогенетического контроля не позволяет своевременно обнаружить факт контаминации. Все это требует применения современных методов цитогенетического анализа как для контроля за «чистотой» данной линии, так и для получения детальной цитогенетической характеристики.
На сегодняшний день с помощью данного метода могут успешно решаться следующие задачи: 1) межвидовая и внутривидовая идентификация линий; 2) кариологическая паспортизация линий; :3) контроль стабильности кариотипа или его изменчивости в процессе длительного культивирования клеток; 4) оценка действия на клетки различных факторов (онкогенов, вирусов, радиации, химических агентов и др.); 5) сравнение между собой линий, обладающих важными в практическом отношении свойствами с помощью нового приема реконструирования кариотипа; 6) выявление точек разрывов на хромосомах и сопоставление их с локализацией онкогенов и других
генов, а также фрагильных сайтов, мест интеграции вирусов и др.
Методическая литература, посвященная детальному цитогенетическому анализу линий, практически отсутствует, если не считать описания отдельных методов дифференциального окрашивания хромосом, о которых будет сказано ниже.
Применяемый в настоящее время цитогенетический анализ дает информацию о видовой принадлежности клеток данной линии, интервале изменчивости числа хромосом и модальном классе клеток, присутствии ряда маркерных хромосом в клетках. Однако этой информации явно недостаточно, она часто носит субъективный характер и ограничивает круг задач, которые можно с успехом решать с помощью современного цитогенетического метода.
В данной работе излагаются последовательные этапы цитогенетического анализа клеточных линий, разработанные на основе данных литературы и собственного многолетнего опыта, которые позволяют получить полную информацию как о количественных, так и качественных характеристиках хромосомного состава в клетках различных линий.
Цитогенетический анализ постоянных клеточных линий включает семь основных этапов: 1) приготовление препаратов метафазных хромосом; 2) окрашивание хромосом; 3) количественный анализ метафазных пластинок; 4) приготовление банка образцов нормальных хромосом; 5) кариотипирование клеток; 6), построение обобщенного реконструированного кариотипа линии; 7) локализация «горячих точек» на хромосомах.
Необходимо подчеркнуть, что последние два чрезвычайно важных и наиболее информативных этапа цитогенетического анализа могут быть выполнены только при условии идентификации всех маркерных хромосом в, линии. Ниже приводим подробное описание каждого этапа кариологического анализа.
•(
Приготовление препаратов метафазных хромосом'
Остановка митоза на стадии метафазы. В активно растущую культуру добавляют колхицин в концентрации 0.05—0.1 мкг/мл на 1 —
2 ч. Время введения и срок действия колхицина или колцемида устанавливаются эмпирически. Обычно генерационное время культуры варьирует от 20 до 40 ч. Чтобы получить достаточное количество митозов, лучше использовать культуры в логарифмической фазе роста через 48 ч после пересева.
