Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
4 47 12 2 2 2 0 1 1 2 0 1 2 0 1 --- --- 1 1
-ч 15 49 13 1 2 1 0 1 1 2 0 1 1 1 1 1 1 1 1
сомы 8 в составе маркера М5. Этот вывод должен быть проверен с помощью сопоставления характера G-исчерченности маркера М5 с таковым хромосомы 8. Другой пример — при наличии в клетках по два гомолога хромосомы 3 и X маркеры Мз и М4 отсутствуют, в то время как в остальных клетках, содержащих по одной копии этих нормальных хромосом, маркеры Мз и М4 выявляются всегда.
Проведенный таким образом анализ взаимосвязанных изменений числа копий нормальных и маркерных хромосом позволяет получить дополнительную информацию о происхождении некоторых маркеров, в том числе представляющих известную трудность для идентификации [28].
Установление происхождения маркерных хромосом. Процедуры, описанные'в двух предыдущих разделах, входят в процесс идентификации и установления происхождения маркерных хромосом. Как уже указывалось, на этих этапах анализируется только G-окрашенные хромосомы. Однако несмотря на высокую разрешающую способность метода в некоторых линиях удается установить происхождение лишь 70—80 % маркерных хромосом. Поэтому при анализе маркеров в линиях следует также использовать методы дифференциального окрашивания хромосом для выявления С-дисков и активных ЯО. С этой целью дополнительно фотографируют и анализируют 5 мета-фазных пластинок, окрашенных на С-диски, и 10 метафазных пластинок, окрашенных методом серебрения ЯО. При сопоставлении характера распределения G-, С-дисков и активных ЯО на одних и тех же маркерных хромосомах удается установить их фрагментарный состав и уточнить локализацию мест разрывов нормальных хромосом при образовании маркеров. Особенно полезно использовать на этом этапе работы хромосомы прометафазного типа, как маркерные, так и нормальные из банка образцов.
Как показывает анализ, основным типом хромосомных перестроек при образовании маркеров в клетках постоянных линий человека и животных являются транслокации робертсоновского и неробертсоновского типа, затрагивающие две хромосомы. С меньшей частотой встречаются терминальные делеции, транслокации, затрагивающие три хромосомы, а также интерстициальные делеции, инверсии и
до - - i(3',5)(3<i ter —cm —5ц ter
1 *
. V _ del(1)(q23 '¦)
M2 %
Рис. 10. Образец записи формул трех маркерных хромосом Mi, М2 и Мз.
дупликации. Особым типом структурных изменений хромосом следует считать амплификации, о наличии которых можно судить по появлению на хромосомах гомогенно или дифференциально окрашенных областей, а вне хромосом — двойных микрохромосом [29].
В окончательном виде происхождение маркеров представляется в виде формул, составленных для каждого маркера в соответствии с принципами идентификации и обозначения маркерных хромосом [18]. При написании формул происхождения маркеров приняты следующие обозначения: q — длинное плечо, р — короткое плечо, t — транслокация, del — делеция, inv — инверсия, i — изохромосома, der — дериват, ter — терминальный район, сеп — центромерный район, г — кольцевая хромосома.
На рис. 10 приводятся примеры записи формул маркеров при различных способах их возникновения.
Построение обобщенного реконструированного кариотипа линии
Благодаря идентификации фрагментарного состава всех маркерных хромосом в линии удается определить суммарный хромосомный материал по каждой нормальной хромосоме в проанализированных кариотипах. Для этого маркерные хромосомы или их фрагменты
располагают в соответствии с общепринятой схемой нормального кариотипа данного вида на месте тех нормальных хромосом, из материала которых они происходят. Поскольку из хромосом, вовлеченных в структурные перестройки, при таких построениях происходит восстановление или реконструкция условно нормальных гомологов, то сформированный таким образом кариотип носит название реконструированного. Результаты реконструкций, выполненных на отдельных клетках, суммируют и на этой основе выполняют построение обобщенного реконструированного кариотипа линии [14, 15, 28, 30, 31].
Важно подчеркнуть, что выполнение данного приема может быть осуществлено только на основе полной идентификации всех маркерных хромосом в линии и установления точной локализации мест разрывов на хромосомах. Описанные построения не являются трудоемкой задачей, так как их практически проводят с помощью схематических изображений хромосом, не прибегая к изготовлению дополнительных фотоотпечатков. При этом число выполняемых реконструкций, как правило, значительно меньше, чем число анализируемых клеток, так как практически в любой линии имеются идентичные или сходные по набору хромосом кариотипы. В качестве примера представлены типичный и реконструированный кариотипы линии клеток Raji (рис. 11, а и б, см. вклейку).
Использование для анализа постоянных линий обобщенных реконструированных кариотипов дает возможность получить новую цитогенетическую характеристику линии. Эта характеристика включает информацию о возможных нехватках или приобретениях хромосом или &% фрагментов по отношению к нормальному диплоидному кариотипу клеток данного вида, о характере вовлечения в перестройки отдельных хромосом и о степени их изменчивости. Обобщенный реконструированный кариотип (ОРК) — более стабильная цитогенетическая характеристика клеточной линии, чем ее модальный класс или модальный кариотип, так как в пределах одной клеточной популяции клетки с различными кариотипами могут иметь сходный ОРК, что свидетельствует о сбалансированности хромосомного материала в клетках одной популяции [28, 32]. Сравнение линий или сублиний между собой с помощью ОРК позволяет установить сходство или различие их по суммарному хромосомному материалу, дает возможность следить за хромосомными изменениями в линии в процессе их длительного культивирования или селективного отбора.
