Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Долю полиплоидных клеток подсчитывают отдельно под микроскопом, анализируя с этой целью 1000 рутинно окрашенных метафаз-ных пластинок на 2—3 препаратах. При этом оценивается только уровень плоидности без точного подсчета числа хромосом, если этого не требуют условия эксперимента. В большинстве клеточных линий доля полиплоидных клеток не превышает 3—5 %, а уровень плоидности — 4п, где 2п соответствует модальному классу клеток анализируемой линии [15]. Наряду с этим известны линии, например линия клеток человека Molt-4, где модальный класс клеток уже на ранних пассажа'х представлен клетками с 92—98 хромосомами [16].
Доля полиплоидных клеток может меняться в процессе длительного культивирования некоторых линий, приводя к замещению класса диплоидных клеток полиплоидными. Преобладание клеток того или иного класса плоидности может также зависеть от способа пересева. В частности, пересев клеток монослойных культур с помощью воздействия на них трипсина дает преимущество клеткам околодиплоид-ной популяции, имеющим большую адгезию, в то время как пересев клеток с помощью механического встряхивания способствует лучшему сохранению клеток околотриплоидного и тетраплоидного клонов [17]. Все вышесказанное еще раз свидетельствует о необходимости проведения регулярного цитогенетического контроля длительно культивируемых клеточных линий.
Приготовление банка образцов
нормальных хромосом
Важным подготовительным этапом, предшествующим кариотипи-рованию клеток любой постоянной линии, является приготовление банка образцов нормальных хромосом данного вида. Использование такого банка является целесообразным на всех этапах кариотипиро-вания, так как это способствует стандартизации проводимых исследований, возможности сопоставления результатов различных
экспериментаторов и надежному определению видовой принадлежности клеток как вновь получаемых, так и длительно ведущихся линий. Банк нормальных хромосом следует использовать для разграничения нормальных и структурно перестроенных хромосом в кариотипе линии путем многократного сопоставления каждой идентифицируемой нормальной и маркерной хромосомы с образцами банка.
Материалом для банка образцов нормальных хромосом служат культуры клеток крови, костного мозга, первично трипсинизирован-ных культур тканей или органов, а также клеток диплоидных клеточных линий с ограниченным сроком жизни, полученных от человека или животных, не имеющих наследственных или злокачественных заболеваний. Следует подчеркнуть, что независимо от анализируемого вида эффективность применения банка образцов в значительной мере зависит от качества дифференциального G-окрашивания самих нормальных хромосом банка, а также хромосом исследуемой линии. В таком банке должно быть представлено не менее 20—30 образцов фотоотпечатков каждой пары G-окрашенных хромосом, различающихся между собой по степени спирализации (рис. 7, см. вклейку). Фотографии гомологичных хромосом располагают на листе горизонтальными рядами согласно общепринятой номенклатуре данного вида.
Номенклатура G-окрашенных хромосом разработана для человека [18], мыши [19], крысы [20] и таких домашних животных, как бык, овца, свинья, лошадь, козел, кошка, кролик [21]. Для ряда биологических видов существуют оригинальные авторские описания, принятые и другими исследователями.
Для проведения полного цитогенетического анализа постоянной клеточной линии, включающего выявление структурного гетерохроматина и ЯО, необходимо кроме основного банка G-окрашенных образцов иметь дополнительные наборы образцов фотоотпечатков нормальных хромосом соответствующего вида, окрашенных для выявления С-дисков и районов ЯО. Число и тип образцов в дополнительном банке нормальных хромосом определяются спецификой конкретного вида.
Например, в нормальном кариотипе человека крупные блоки структурного гетерохроматина присутствуют только на хромосомах 1, 9 и 16-й пар и Y-хромосоме, а ядрышкообразующими являются хромосомы групп D (13—15-я) hG (21—22-я). В нормальном кариотипе мыши околоцентромерные блоки структурного гетерохроматина выявляются практически на всех хромосомах, за исключением Y-хромосомы [22], а ядрышкообразующими являются хромосомы 12, 15, 16, 18 и 19-й пар [13, 23, 24].
На хромосомах крысы структурный гетерохроматин небольшого размера занимает прицентромерное положение [25]. Ядрышкообразующими являются хромосомы 3, 11 и 12-й пар, причем интенсивность окрашивания их ЯО нитратом серебра служит хорошим критерием межлинейных отличий у инбредных крыс [26]. Что касается таких видов, как зеленая мартышка, макака резус, бык, собака, кошка, крыса, сирийский и китайский хомячки, то сведения о харак-
тере распределения структурного гетерохроматина и районов ЯО на хромосомах этих животных даны в статье Патака и Хсю [9], в атласе хромосом лабораторных и домашних животных [27], а также приведены на рис. 4.
Кариотипирование клеток
Как известно, в кариотипе клеток большинства постоянных клеточных линий имеются как нормальные хромосомы, представленные различным числом гомологов, так и структурно перестроенные. Если последние обнаруживаются в анализируемой выборке клеток не менее чем в двух клетках, их считают маркерными хромосомами данной линии. Однократно встретившиеся структурные перестройки относят к классу редких. Число маркерных хромосом в разных линиях может колебаться от 1—2 до 20—30 и более [15]. С увеличением выборки, т. е. числа кариотипированных метафазных пластинок, число обнаруживаемых редких структурных перестроек всегда нарастает. При этом количество маркерных хромосом остается неизменным в одних клеточных линиях, в то время как в других может нарастать. Такие различия между линиями обусловлены разной степенью кариотипической гетерогенности клеточного состава.
