Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Длительность хранения в жидком азоте практически не лимитирована при условии, что ампулы не выступают над его поверхностью, так как температура над ней быстро повышается с высотой [32, 33]. Оттаивание должно быть как можно более быстрым. Для этого ампулы встряхивают в воде с температурой 40, иногда даже 60 °С. Но как только начинает исчезать последний кристаллик льда, ампулу переносят в сосуд со льдом.
Отмывание от криопротектора применяется только в случае веществ, токсичных для данных клеток, но для меристем оно не обязательно, так как их извлекают из ампул почти без криозащитного раствора. Содержимое ампулы разбавляют в 3—4 приема с 15-минутными интервалами большим объемом холодной питательной среды или 3—15%-ной сахарозы. Повышенная концентрация сахарозы полезна для замедления деплазмолиза, если криопротектор вызывал плазмолиз. Затем обычно клетки просто отстаивают, а надосадочную жидкость заменяют питательной средой, объем которой приблизительно равен исходному объему суспензии. Наиболее чувствительные к манипуляционным и осмотическим стрессам клетки лучше отмывать на фильтровальной бумаге с загнутым краем диаметром 4—5 см, помещенной с помощью подставки на поверхность холодного раствора (50 мл) сахарозы в большой чашке Петри. В такой системе достаточно 15—20 мин при 2 °С для диффузии ДМСО в раствор [34].
Полное отмывание достигается однократной сменой раствора. Фильтр с клетками переносят затем для рекультивирования на поверхность питательной среды в маленькую чашку Петри или Коха.
Наиболее простой, быстрый и вполне удовлетворительный способ оценки жизнеспособности клеток после оттаивания — окраска витальным красителем. Для этого смешивают каплю суспензии и каплю
0.1.-ного феносафранина или 0.25%-ного синего Эванса. Смотреть под микроскопом можно сразу, окраска мертвых клеток устойчива не менее 30 мин (живые клетки не окрашены). При использовании флюоресцирующего красителя флюоресцеиндиацетата, наоборот, не окрашены мертвые клетки, но в этом случае смотреть можно только через 6 мин, окраска менее стабильна и нужен люминесцентный микроскоп [35]. Так как основная масса клеток обычно сосредоточена в агрегатах с числом клеток более 10—15, где клетки маскируют друг друга и сосчитать их невозможно или трудно, то рекомендуется считать агрегаты (200—500 на препарат), отмечая агрегат живым, если половина или больше его клеток не окрашены, и мертвым, если больше половины клеток окрашены [12]. Другие способы оценки имеют свои преимущества, но требуют больше времени и не повышают точность [36]. Окончательным критерием, разумеется, служит четкое возобновление роста при рекультивировании после оттаивания.
Для этого следует распределить суспензию (около 1 мл) из одной или двух-трех ампул на поверхности агаризованной питательной среды (5—6 мл) в чашке Петри, Коха или в небольшой колбочке. Чашки заклеивают парафилмом, причем для лучшего газообмена чашки Коха можно заклеивать не сплошь, а секторами. После прилипания клеток к агару (через 2 сут) лучше отсосать избыток жидкости. Полезно использовать также чашки с жидкой средой и мостики из фильтровальной бумаги, на которые помещают фильтры или целлофановые диски с клетками. Объем среды должен быть минимальным. Жидкая среда улучшает метаболизм, ускоряет рост и позволяет легко заменять ее не целиком, а наполовину, чтобы сохранить факторы кондиционирования. На отдельный мостик в ту же чашку можно посадить ткань-няньку (хорошо растущий каллус в экспоненциальной фазе, его лучше менять на новый через каждые 4—5 сут [34]) или применять кормящий слой [13]. Если клетки до замораживания закаливали, то мы ставили чашки на ночь в камеру, где было 2 °С, утром переносили в камеру с 10 °С, на следующую ночь оставляли в комнате и только потом помещали в обычные условия (25—26 °С). Возобновление культур требует от 2 до 6 нед.
Литература
1. Туманов И. И., Бутенко Р. Г., Оголевец И. В. Применение метода изолированных
тканей для изучения процессов закаливания растительной клетки // Физиол.
растений. 1968. Т. 15. С. 749—756.
2. Qua.tra.no R. Freeze-preservation of cultured flax cells utilizing dimethyl sulfoxide //
Plant Physiol. 1968. Vol. 43. P. 2057—2061.
3. Nag K., Street H. Carrot embryogenesis from frozen cultured cells //Nature.
1973. Vol. 245. P. 270—272.
4. Chen Т., Kartha К., Loung N. et al. Cryopreservation of alkaloid-producing cel!
I cultures of periwinkle (Catharanthus roseus) // Plant Physiol. 1984. Vol. 75.
P. 726—731.
5. Kartha K. Cryopreservation of plant cells and organs // IAPTC Newsletter. 1985.
Й N 45. P. 2—15.
- 6. Nei Т., Asada M. Changes appearing in the rewarming process of rapidly frozen erythrocytes // Low Temperature Sci. B. 1972. Vol. 30. P. 45—64.
7. Самыгин Г. А. Причины вымерзания растений. М., 1974. 190 с.
^ 8. Бутенко Р. Г., Попов А. С., Волкова Л. А. и др. Жизнеспособность клеток растений . В при различных режимах глубокого замораживания // Цитология. 1983. Т. 25.
t; С. 1191 — 1196.
