Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
4) добавить 3 мл стерильного изотонического раствора на /10 мин;
5) удалить изотонический раствор, посеять клетки ? полной ростовой среде. 1
Вместо коллагена [s 16] многие ислользуют очищенную желатину (денатурированный коллаген);:. 11), к 1 г желатины добавить 40 мл дистиллированной воды, оставить на 2—3 ч для набухания; 2)! слегка нагреть набухший гель на водяной бане до полного растворения; 3) полученный раствор простершшзовать на кипящей водяной бане 30 мин; 4) разлить полученный раствор по 0.3—0.5 мл на чашки Петри диаметром 50—60 мм;, после высыхания раствора образуется танкая желатиневая пленка; 5> перед внесением клеток добавить 2*—3 мл PBS, инкубировать 2—3 ч при 37 °С, затем слить.
Следует отметить перспективность выращивания скелетно-мышечных клеток на декстрановых микроносителя*. Одноядерные миогенные клетки не только прикрепляются и растут, но и дифференцируются на такой поверхности. Система микроносителей позволяет увеличить ш;бщую поверхность клеточного прикрепления. Удобство системы «же и в том, что в любой нужный момент можно стерильно отобрать необходимое количеств®м-атериала для биохимических, электронно-микроскопических или других исследований [17].
Дифференцировка
з шюгенных клеточных- культурах
Первичные культуры. Одноядерные миобласты прикрепляются к субстрату и начинают делиться. При достижении высокой плотности в культуре ©ни сливаются в миотубы. Процессы дифферечцировки и пролифераззди скелетно-мышеяных клеток, находятся в обратной зависимости!. Усилению миогенеза способствует применение ингибиторов синтеза ДНК. В основном используют цитозинарабинозид в кошдентрации 1 мкг/мл. Такой же эффект достигается понижением концентрации сыворотки до 1—2 %. Ингибиторы пролиферации добавляют в культуры с высокой плотностью клеток.
Суспензию клеток, обогащенную миобластами, высевают на чашки Петря;, гаокрытые коллагеном или желатиной, в концентрации 2 • 105 клеток/мл в ростовой среде с ГО'% сыворотки. Через 24 ч среду сменяют (удаляют неприкрепившиеся, нежизнеспособные клетки). Еще через сутки среду меняют на содержащую 2 % сыворотки.
%
%*•*
* *1
” _шт ЯтАы- Ш *ш? __ ;fe'“
'v-^C
М' V \, »
Л ; ' *
»*
ч
!# 4Ь
чГ *
ДГ*«#; *
• Ir
¦#л « * *
tfHBS JP ¦
^ЧИЩг W В
Рис. 1. Метафазная пластинка, окрашенная рутинным способом, с сохранившейся цитоплазмой на препаратах, предназначенных для количественного анализа.
Рис. 2. Метафазная пластинка с окрашенными на С-диски хромосомами клеточной линии мыши LS.
Стрелками отмечены маркерные хромосомы.
. «а. VI a J
И i я~ -
§vC
m - ap^”" ~ | *
v* -%* "^•...
? •*
* (*. 'i
.. ’“‘if8- »...J
M **%
Рис. 3. Фрагменты метафазных пластинок, окрашенных на G-дяски,
Воздействие трипсина на хромосомы: а — недостаточное, б — удовлетворительное, в — слвш-ком сильное.
'i I
r F ,r, ¦'if
X
/
> i
г I
V
1
^ % '
ш
. 1 м
1
* Р ^
А # .
Ж Ш Й
Щ w** ¦
* 1
0* 1
ft» .
Рис. 5. Метафазная пластинка с окрашенными на С-диски хромосомами клеточной линии Namalva (лимфома Баркита).
Стрелками указаны хромосомы 1, 9 и 16 с крупными С-блоками и маркерная хромосома с двойным С-диском (дериват хромосомы 1).
Рис. 6. Метафазная пластинка постоянной линии Daudi (лимфома Баркита) с девятью Afij-позитивными хромосомами (отмечены стрелками).
Рис. 7. Фрагмент банка образцов нормальных хромосом человека, имеющих разную степень спирализацни.
” jHjjj i 1 * ® ?B fit *%-
-й jrrr 20 * *
Z1 4~ .
22Г|5~*~#“*“4“
. г ¦ rS a
IB _ f _ xI=i v/ ri f
if j-i3H # 1 Ж 1 H ^ *• ™
7TS § " • • m 2 :D w
Рис. 7 (продолжение).
6
73
i*—I!
19 20
Маркеры _
V
f
5
Ш
-HrU
10 11 18
iiV.l
16
17
## If'
2/
ж
n
1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Рис. 8. Кариотпп клетки постоянной линии Namalva, 2n=47X. В нижнем ряду — 12 маркерных хромосом.
Мар Мвтснразы
1 2 >3 if 5 5 7 С-блоки
щ ! m i- ¦ 4 4
f * #
1
•
Is -ш- ~I--- -ii- -Il -I-
