Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
где они формируют как костную, так и хрящевую ткань. Обычные методы культивирования непригодны для изучения дифференциро-вочных потенций стволовых остеогенных клеток. Поэтому до последнего времени не удавалось применить методы культуры in vitro для анализа факторов, регулирующих дифференцировку стволовых остеогенных клеток, и для оценки костеобразовательного потенциала костного мозга. Такую возможность особенно важно иметь для костного мозга человека, для которого аутотрансплантация как метод анализа, естественно, неприменима.
Культуральная система, позволяющая получать полную дифференцировку костной ткани в эксплантатах костного мозга, была создана в ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи АМН СССР в 1985 г. [9] на основе ранее разработанного приема культивирования костного мозга методом множественных органных культур [10]. Система дает возможность получать костеобразование при культивировании как фрагментов костного мозга;, так и суспензий костномозговых клеток. Ниже эта система излагается применительно к костному мозгу мышей; она применима и для костного мозга человека.
Культуральная система. Культивирование фрагментов костного мозга и суспензий костномозговых клеток проводится по методу множественных органных культур на миллипоровых фильтрах HAWP (диаметр пор 0.45 мкм) и AUFS (диаметр пор 1.2 мкм) площадью 64 мм2, помещенных на разделе двух фаз — жидкой питательной среды и газовой фазы. В периферическую часть чашки Конвея помещается пластмассовая платформа в форме кольца: наружный диаметр 50 мм, толщина 2 мм, на ножках высотой 2 мм. Платформа содержит 12 сквозных отверстий, имеющих форму усеченного конуса. В центральную часть чашки Конвеяу отделенную стеклянным бортиком, наливается раствор Хэнкса, в периферическую часть — питательная среда, после чего миллипоровые фильтры раскладываются над отверстиями таким образом, чтобы нижняя их поверхность смачивалась средой. После эксплантации ткани и заполнения чашки Конвея газовой смесью она герметически закрывается стеклянной крышкой, которая приклеивается замазкой (смесь вазелина с 10 % воска).
Культуральная среда. Используется следующая пропись питательной среды, которая является наиболее благоприятной для образования минерализованной кости в культурах костного мозга мыши и человека: а-МЕМ 80 %, сыворотка — 20 %, витамин С — 0.15 мг/мл, глюкоза — 4 мг/мл, L-глютамин — 0.5 мг/мл, Na-P-гли-церофосфат — 3 мг/мл (0.01 М), антибиотики пенициллин и стрептомицин — по 60 ед/мл. Витамин С и глюкоза применяются в виде растворов, выпускаемых отечественной медицинской промышленностью. Растворы L-глютамина и глицерофосфата готовятся из порошков на тридистиллированной воде и стерилизуются фильтрацией через мил-липоровый фильтр GS (диаметр пор 0.22 мкм).
При подборе компонентов питательной среды оказалось, что судьба эксплантатов во многом определяется качеством применяемой сыворотки. Для культивирования костного мозга мыши используют те серии эмбриональной сыворотки коров, которые обеспечивают
высокую эффективность клонирования стромальных фибробластов в монослойных культурах костномозговых клеток [11], а для культивирования костного мозга человека — свежеприготовленную сыворотку крови IV группы. Синтетическая питательная среда разводится перед употреблением на тридистиллированной воде и стерилизуется фильтрацией через фильтр GS. Высокая концентрация витамина С необходима для осуществления остеогенеза в культурах: интенсивность остеогенеза усиливается с повышением содержания витамина С до 0.20 мг/мл, дальнейшее увеличение дозы на костеобразование не влияет [12]. Стимулирующее влияние на остеогенез in vitro оказывает также введение в состав питательной среды L-глютамина и глюкозы. Однако перечисленных компонентов еще недостаточно для завершенного остеогенеза в культурах костного мозга. Решающая роль при образовании минерализованной кости в культурах принадлежит №-|3-глицерофосфату. В малых концентрациях он входил в питательную среду культур костных зачатков, которые выращивались на поверхности плазменного сгустка [13]. В культурах костного мозга 6Х X 10~4М Na-P-глицерофосфэт не обеспечивает образования минерализованной кости; для этого требуются более высокие концентрации (5. 10~3— I- Ю~2М).
Газовая фаза. Состав газовой фазы имеет большое значение для роста органных культур, которые с ней непосредственно контактируют. Хотя костная ткань in situ всегда хорошо васкуляризирована, повышение содержания кислорода в газовой фазе по сравнению с содержанием его в воздухе не приводит к усилению костеобразования в культурах, а оказывает даже отрицательное влияние на остеогенез'in vitro. В связи с этим газовая фаза органных культур костного мозга должна состоять из смеси воздуха с 5—10 % СОг и быть насыщена парами воды; это достигается герметизацией чашек Конвея после заполнения их газовой фазой либо использованием СОг-инкубатора.
Эксплантация. Фрагменты ткани костного мозга, извлеченные из медуллярной полости бедренной кости мыши либо из ребер и отростков позвонков человека (удаленных при хирургических операциях), помещаются в чашку Петри в синтетическую среду и острой бритвой разрезаются на кусочки объемом около 4 мм3. По одному такому фрагменту помещают (при помощи пастеровской пипетки) на поверхность миллипорового фильтра, лежащего над лункой в платформе.
